第六讲 PCR技术及其应用.pptVIP

* PCR技术及其应用 　　聚合酶链反应 (Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出优点. 　 1971年Korana提出核酸体外扩增的设想 1985,PE-Cetus公司Mullis 等发明了聚合酶链反应。 模板DNA 、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、缓冲体系经变性、复性及延伸完成DNA的体外合成. Klenow片段为聚合酶. 缺点：①Klenow酶不耐高温， 90℃会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。 　 1988年，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，扩增真实性较高，但每循环一次，仍需加入新酶。 　 1988年,Saiki 等从水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶-Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase) 。 特点：①耐高温，在70℃下反应2h后酶残留活性仍大于90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。 ②在热变性时不被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。可以在较高温度下进行复性和扩增，防止DNA的错配，提高了扩增片段特异性、灵敏性及扩增效率，增加了扩增长度。 PCR技术的基本原理 PCR的反应动力学　 PCR反应最终的DNA 扩增量,Y＝(1＋X)n Y:DNA片段扩增后的拷贝数 X:每次扩增效率的平均值 n:循环次数。 平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。 平台期(Plateau) 反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期 产生的因素: ①dNTP和引物浓度下降 ②酶与模板的比例下降，能参与反应的酶分子数下降 ③多次循环后酶与dNTP的稳定性下降 ④非特异产物及引物二聚体比例增加 ⑤产物浓度高时变性不完全，影响引物的延伸，产物浓度过高10－8M时，降低Taq酶的延伸与加工能力。 大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。PCR反应应在平台期前结束。 PCR扩增产物 　 长产物片段和短产物片段 短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5‘端之间，是需要扩增的特定片段。 短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成. 在一个反应周期中， 以两条互补的DNA为模板，引物是从3‘端开始延伸， 其5’端是固定的，3‘ 端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。 第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时， 由于新链模板的5‘端序列是固定的， 这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点， 保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。 “短产物片段”是按指数倍数增加， 而“长产物片段”则以算术倍数增加， 几乎可以忽略不计 　酶及其浓度　 Taq DNA聚合酶, 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。 除Taq DNA聚合酶，还有其它一些热稳定聚合酶。 催化一典型的PCR反应约需酶量5U(指总反应体积为100ul时)， 浓度过高可引起非特异性扩增，甚至PCR产物为弥散，浓度过低则合成产物量减少。 dNTP的质量与浓度　 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP保存不当易变性失去生物学活性。 dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris－HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。 4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。 在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，浓度过低会降低PCR产物的产量。 dNTP能与Mg2+结合，因此浓度过高，使游离的Mg2+浓度降低，并抑制Taq酶活性。 Mg2+浓度　 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响 Mg2+浓度要比dNTP浓度高0.2～2.5mM。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚