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例题 1．关于PCR扩增停滞的原因有很多种，但下列各项中，（　）不是主要原因 A．底物（模板）过剩 B．dNTP的大量消耗 C．产物的聚集 D．非特异性产物的竞争性抑制 2．PCR(聚合酶链式反应)是分子生物学领域最有力的方法之一。下列对PCR的描述错误的( ) A．在PCR中，引物是必需的 B．在PCR中，能够耐受高温的DNA聚合酶是必需的 C．在PCR中，ATP是必需的 D．在PCR中，DNA模板是必需的 3．关于PCR反应的描述，正确的是( ) A．是聚合酶链式反应的简称 B．一般由高温变性、低温退火、适温延伸3个基本反应组成 C．所用DNA聚合酶具有很好的耐热性 D．上述各项 4．下列哪个有关PCR的陈述是不对的 A．PCR需要DNA聚合酶 B．PCR一般需要在高温下进行 C．PCR需要一段RNA引物 D．PCR需要DNA模板 5．聚合酶链式反应（PCR）在法医学中得到普遍应用，主要是因为该技术 （ ） A．灵敏度高 B．需要的目标DNA量少 C．反应时间短 D．不需要合成特定序列的引物 * 目 录 一、PCR技术简史 二、PCR的原理 三、PCR的基本过程 聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction, PCR )： 是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法。 PCR技术简史 1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆基因。 但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了…… PCR技术简史 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR） 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖 DNA引物 RNA引物 引物 加热 解旋酶 解旋 耐热的DNA聚合酶 DNA聚合酶 酶 dNTP dNTP 原料 DNA母链 DNA母链 模板 体外 体内 复制条件 DNA体内复制与体外扩增的条件比较 PCR的基本原理 加热变性 缓慢冷却复性 从一种嗜热水生菌Thermus aquaticus YT-1菌株中分离提纯的。是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离得到的，它生长在70-75度极富矿物质的环境中。 在嗜热脂肪芽孢杆菌及其他一些嗜热菌中也得到类似的耐热DNA聚合酶。 耐热DNA聚合酶(Taq polymerase) 引物(primer) PrimerI PrimerII Amplified target fragment 扩增的目的DNA片段 要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核苷酸引物,实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩增产物的两个5’末端位置。由于引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键， 因此，引物设计也就更为重要。 PCR的基本过程 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） PCR过程 PCR的特点 PCR反应条件 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍 Step 1: 高温变性（94℃） Step 2: 低温退火（55℃） Step 3: 适温延伸（72℃） 多聚酶链式反应技术 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链; 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(55℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对; 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成. 由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目 的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一 轮循环的模板，所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106 倍。 PCR过程 PCR的特点 PCR反应条件 灵敏度高 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 简便、快速 一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 扩增产物一般用电泳分