宏基因组学在微生物学研究中的应用_0.docVIP

宏基因组学在微生物学研究中的应用 宏基因组学在微生物学研究中的应用 一直以来，自然环境中微生物鉴定识别的唯一途径就是用传统的方法进行分离培养，这不但阻碍了人们认识微生物世界的视野，还限制了生物资源的开发和利用。随着分子生物学技术的快速发展，为了研究不能培养的微生物，一个全新的理念宏基因组学应运而生，宏基因组学技术克服了相关培养技术的困难和限制，跳过传统培养而直接从环境样品中提取总DNA，通过构建宏基因组文库、筛选来获得新的功能基因和生物活性物质。宏基因组学的产生和快速发展已渗透到各个领域，包括海洋、土壤、热液口、热泉、人体口腔及胃肠道等，并在医药、替代能源、环境修复、生物技术、农业、生物防御等各方面显示了重要的价值。 　　1 宏基因组学的概念 　　1998年，科学家Handelsman等首次提出了宏基因组（ metagenome）的概念，宏基因组学又称为环境基因组学，或者群落基因组学，它是指环境中全部微生物基因的总和，包含细菌基因组和真菌基因组，所获得的基因是包含了可培养的和还不能培养的微生物的总基因，是目前一种新的微生物研究方法。宏基因组学其显著的特征在于获得环境微生物基因组的方法是非传统培养方法，通过基因筛选和序列分析等手段，来研究环境微生物的功能活性、多样性、种群结构、进化关系，以及它们与环境之间的关系，获得新的酶及生物活性物质，可极大地拓展微生物基因资源的利用空间，研究其功能和彼此之间的关系和相互作用，并揭示其内在规律。 　　2 宏基因组学发展 　　早期对微生物群落的研究，主要是根据微生物的生理特性，通过原位染色标记技术来确定微生物群落的分类。可依据其菌落的形态特征、不同的生长媒介和代谢产物等来区分不同微生物的菌群。但此种方法有很大的局限性，它只可检测到那些在实验室生长条件下容易生长的有机体，但对于研究非培养的微生物有很大的限制。 　　直至发展到免培养技术，即直接从样品中提取总DNA，并用这些DNA来分析物种的多样性，也可描述一个群体不同物种间的关系。早期DNA的方法是通过杂交或者聚合酶链式反应（polymerase chain reaCtion，PCR）扩增特异的靶基因，探索目标群体的DNA，这些研究手段通常能在一个较广泛的层面上描述生物多样性。 　　最早宏基因组分析实验，只用来研究荧光原位杂交（fluorescent in situ hyhridization，FISH）未检测到且未报道过的DNA菌群，只限定在16SrRNA的标记基因，之后可用它来识别群体特定酶区域的功能基因探针。早期的宏基因组学分析主要针对于细菌和真菌，直至2002年，BrEitbart等应用宏基因组学方法分析海水中的微生物种群，发现噬菌体是海水中的丰要病毒，这一研究开启了病毒宏基因组学（viral metagenomics）研究，为宏基因组学研究迎来新局面。为了更高效地分析微生物群落，大多数的研究都采用了高通量测序技术。新一代高通量测序技术的广泛应用及性价比较高的DNA测序技术，宏基因组的研究也随之被普及。 　　3 宏基因组学研究方法 　　3.1 基因组文库构建 　　DNA提取，获得高质量的总DNA是宏基因组文库构建的关键因素之一，DNA提取方法主要有2种：一种是直接裂解法，直接裂解环境样品中的微生物细胞进行DNA抽提。另一种是间接裂解法，即先采用差速离心等物理手段，将微生物细胞从环境样品中分离出来，再用较温和的方法来对DNA进行抽提。 　　3.1.1 载体选择。DNA提取后构建文库，在文库构建过程中，载体是文库构建所必需的因素。载体选择主要考虑是否有利于目标基因扩增、表达，以及在筛选细胞毒类物质时表达量的调控等。目前多采用细菌人工染色体（BAC）和粘粒（Cosmid）或Fosmids载体。1992年SHIZUYA等研究表明，用BAC载体可插入片段，但克隆效率低；用Fosmids载体可插入中等大小片段（38-52kb）克隆，克隆效率较高。 　　3.1.2 宿主的选择。宿主菌株的选择主要考虑：转化效率、载体在宿主细胞稳定性、宏基因的表达、目标性状筛选等因素。不同微生物种类所产生的活性物质类型有明显差异，因此可根据研究目标的不同选择不同的宿主菌株。目前，构建宏基因组文库最常用的宿主有大肠杆菌、青链霉菌和恶臭假单胞杆菌、根癌土壤杆菌、黄单胞菌、根瘤菌等。 　　3.2 宏基因组文库的筛选 　　目前用于宏基因组文库的筛选方法主要有功能筛选法、序列筛选法、化合物结构筛选法和底物诱导基因表达筛选法4种。 　　3.2.1 功能筛选法。基于克隆子产生新的生物活性进行筛选，通过建立和优化合适的方法，从基因组文库中获得具有特殊功能。如抗菌素耐药性基因、酯酶、脂肪酶、膜蛋白质、几丁质酶、4-羟基丁酸的基因编码酶等常用物质。通过功能性筛选的方法，可以快速地从多个克隆子中