动物细胞培养实验策画.docVIP

动物细胞培养技术 实验报告 生物技术1004班 第四组 实验一 仪器的清洗与灭菌及培养基的配制 一、实验目的 能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。 二、实验原理 清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。如有毒的化学物质，哪怕残留0．1，也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。 (1)紫外线消毒 用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿，如塑料培养皿、培养板等。这是常使用的消毒方法之一。 ()湿热灭菌 (如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如Hanks液、PBS、20×SSC等)。 ()滤过除菌以0．22 μm除菌最为保险，但对于较粘稠难滤过的液体，仍需选用孔径较大的滤膜。()化学消毒法 70％(或75％)酒精：超净台里常备70％酒精棉球(卫生级酒精)，用于手和一些金属器械或工作台面的消毒。材料：???PH、注射滤器（0.22微米微孔滤膜药品：7％酒精，培养基干粉、胰蛋白酶，青霉素、链霉素KH2PO4 ，N，NaHCO3 ，KCl ，Na2HPO4.H2O?? 3．仪器：超净台，高压锅，电子天平。(一)1．玻璃器皿的清洗先用自来水刷洗，再浸泡用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗10次，蒸馏水涮洗3次，倒置自然干燥。包装(牛皮纸或一般纸)高压灭菌。 贮存备用。 1．先用清水清洗之后再用 2．用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗10次，蒸馏水涮洗3次，倒置自然干燥。包装(牛皮纸或一般纸)高压灭菌。 贮存备用。 用洗涤剂清洗，自来水清洗10次，蒸馏水涮洗3次，倒置自然干燥。包装(牛皮纸或一般纸)高压灭菌。 1. 水： 细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水. 2. Hanks液的配制：Na2HPO4.H2O??0.06g 2将乙液徐徐加入甲液中。 KH2PO4 0.06g 3将0.35g NaHCO3 单独溶解到37℃ 100ml三蒸水中 MgSO4`H2O 0.20g 4用数滴NaHCO3液溶解0.02g酚红 葡萄糖1.00g 5将(3) (4)液移入甲乙混合液中 NaCl 8.00g 6用三蒸水定容至1000ml，充分混匀调pH到7.4，膜 三蒸水 100ml 封口4℃冰箱过夜。 乙液 7次日滤过 ，分装4℃冷藏。 CaCl2 0.14g 三蒸水 100ml3. 胰蛋白酶溶液：　　称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。搅拌混匀，置于4内过夜。用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。到7.2然后分装成小瓶于保存以备使用。 倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的溶液。调PH到。用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于-保存以备使用。 保存以备使用1．清洗玻璃制品时要用棉花或柔软纱布擦洗。千万不要用硬毛刷，否则损害塑料表面后细胞不易贴壁。2． 高压灭菌后器皿务必晾干或烘干，以防包装纸潮湿发霉。 3．牛血清、大部分培养基、胰酶和一些生物制剂是有机溶液，均不能高压。 5．滤过除菌时，过滤时压力不宜过大。压力太大时微孔滤膜可能破裂。 6．。 Hanks液主要用于组织或细胞的漂洗胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所