1433γ和ζ蛋白在小胶质细胞中表达变化的研究.docVIP

14-3-3γ和ζ蛋白在小胶质细胞中表达变化的研究 　　作者：何静 孙圣刚 陈小武 作者单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院神经内科，湖北 武汉 430060 武汉市第三医院 　　【摘要】 目的 了解14-3-3Γ和Ζ蛋白在中枢神经系统小胶质细胞中的表达及脂多糖(LPS)刺激后其表达变化情况，探讨14-3-3蛋白与小胶质细胞释放炎症因子的关系。方法 应用小鼠小胶质细胞株BV-2作为体外小胶质细胞的模型，以LPS刺激其活化，应用免疫荧光、流式细胞术检测14-3-3Γ和Ζ蛋白在刺激前后的表达变化，ELISA检测TNF-Α的表达。结果 小鼠小胶质细胞株BV-2在未刺激状态下表达14-3-3Γ和Ζ蛋白;LPS刺激细胞活化后释放TNF-Α，同时14-3-3Γ和Ζ蛋白表达下降。结论 正常小鼠小胶质细胞高表达14-3-3Γ和Ζ蛋白，LPS刺激后表达下降，提示其参与了中枢神经系统免疫应答的调节。 　　【关键词】 14-3-3蛋白;小神经胶质细胞;脂多糖(LPS);肿瘤坏死因子(TNF) 　　帕金森病(PD)是一种多发于老年期的中枢神经系统退变性疾病。小胶质细胞在中脑黑质致密部分布密度明显高于其他脑区，与PD的发病密切相关;在PD患者脑中，激活的小胶质细胞释放大量的致炎性因子(TNF-Α，IL-1Β，IFN-Γ等)，一氧化氮(NO)，活性氧产物(ROS)和花生四烯酸代谢产物对多巴胺能神经元产生毒性作用，并以瀑布效应的方式形成恶性循环，最终可导致多巴胺能神经元的退变死亡〔1〕。近年来，对PD发病机制的研究主要集中在线粒体功能异常、氧化应激、蛋白表达和折叠异常、蛋白降解功能障碍、炎症反应、神经营养障碍等几个方面。14-3-3蛋白家族是真核细胞中高度保守并广泛表达的可溶性蛋白。在细胞凋亡、生长、增殖的信号转导、细胞周期的调控及细胞间运输中发挥重要的调节作用〔2〕。已有研究发现在PD患者脑黑质中，可溶性Α-Synuclein复合物的含量增加，其中含有14-3-3蛋白〔3〕，且Lewy小体的免疫组化显示14-3-3蛋白染色强阳性，以上研究说明14-3-3蛋白参与了PD脑的异常蛋白表达及细胞凋亡，但是否也参与了PD的炎症反应过程，国内外尚未报道。本研究用BV-2细胞作为小胶质细胞体外模型，LPS作为工具药激活小胶质细胞，建立炎症/免疫异常细胞模型，用免疫组化及流式细胞术观察14-3-3Γ 和 Ζ蛋白的表达变化，探讨其与脑内免疫炎症的关系。 　　1 材料与方法 　　1.1 主要材料及试剂 　　小胶质细胞(BV-2)购于中国协和医科大学细胞中心，脂多糖(LPS)，E.coli 026B6购于Sigma公司，高糖DMEM培养基(Gibco公司)，胎牛血清(武汉三利)，14-3-3蛋白多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnologies),荧光二抗FITC(武汉凌飞)，TNF-Α ELISA检测试剂盒(武汉晶美)。 　　1.2 BV-2细胞培养 　　冻存复苏后的第一代细胞培养在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，加PG 100 U/ml;培养条件37℃恒温，5%CO2，95%空气。隔天换液一次，3～4 d传代1次。取第3～8代的细胞为实验对象，实验前无血清培养过夜，使细胞处于同步化状态。 　　1.3 LPS诱导激活及分组 　　LPS溶于无血清无抗生素的DMEM，先配成1 mg/ml的贮存液，-20℃保存，工作浓度为500 ng/ml。细胞经无血清培养过夜后，加入含LPS 500 ng/ml的DMEM培养，分别在2，6，12，24 h收集细胞及细胞上清，并设正常培养的细胞为对照组。 　　1.4 免疫荧光检测14-3-3Γ和Ζ表达方法 　　细胞爬片制备后用丙酮4℃固定20 min。PBS充分洗涤，5%山羊血清室温封闭30 min，一抗(浓度1∶100)4℃孵育过夜，PBS充分洗涤，二抗FITC(浓度1∶50)室温闭光孵育40 min，PBS洗涤晾干后，缓冲甘油封片，Olympus BX51荧光显微镜观察并摄像。免疫荧光结果采用Olympus MicroImage 4.0图像处理系统进行图像分析。200倍视野下，抽取30个不相重复的视野测量14-3-3Γ的吸光度值。流式结果取105个细胞，观察14-3-3Ζ表达的百分率以及平均荧光强度。 　　1.5 流式细胞仪检测14-3-3Ζ表达方法 　　用流式管分别收集不同时间点细胞，70%冷乙醇固定，PBS洗涤，0.25%TritonX-100破膜5 min，PBS洗涤，一抗4℃孵育过夜，FITC二抗室温闭光30 min。充分洗涤后，用流式细胞仪检测。 　　1.6 TNF-Α分泌检测