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单克隆抗体制备技术的研究进展 摘要：单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要工具，它可用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系;生产出针对复杂生物混合物中的特定分子的抗体,可用于离、分析及纯化该特定分子抗原;其试剂可用于临床诊断和治疗,或用于以单抗为弹头的“生物导弹”药物等。1975年,Kohler和Milstein创立了杂交瘤技术制备单克隆抗体( monoclonal antibody，McAb)所谓 McAb 是利用 HAT 培养基筛选出既能稳定生长又能产生抗体的杂交瘤细胞，杂交瘤细胞分泌的抗体是由识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产生的具有高度特异性和均一性的抗体，故称之为 McAb。单克隆抗体技术自问世以来,在临床治疗方面进展缓慢,一方面，鼠源单抗与自然杀伤细胞等免疫细胞表面 Fc 段受体亲和力弱，产生的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用较弱，对肿瘤细胞的杀伤能力较弱，人血循环中的半衰期短，它发挥细胞毒作用作用的时间较短; 另一方面，鼠 McAb 还具有免疫原性，产生人抗鼠抗体，既降低单抗的治疗效果，又诱发变态反应。1．1． 产生于1980年代中期,是应用DNA重组技术将人 McAb 的恒定区基因替换鼠 McAb 的恒定区基因，从而编码产生的 McAb1980年代中后期,科学家对嵌合抗体进一步改进后,抗体基因只有互补性决定区(CDR)是鼠源成分,其余均为人基因序列,将鼠源性单抗在保留其抗原结合活性的基础上，尽可能去除鼠源化部分或代之以人源化片段，从而尽可能减少单抗的异源性根据所用的载体质粒标记基因产物,选用适当的抗生素或试剂进行筛选,再用与传统杂交瘤技术相似的方法克隆出分泌人鼠嵌合抗体的细胞株。 嵌合抗体不但具有与鼠源单抗相同的特异性、亲和力和产量,而且可根据不同的需要接上不同亚类的人恒定区基因来改变抗体的功能,使用更加灵活。这实现了抗体的高度人源化,但仍,并未完全解决鼠抗体的免疫原性问题,而且人源化过程繁复且费用昂贵,大量的反复试验不可避免。因此又发展出了产生全人单克隆抗体的技术。 1． 人源化抗体 人源化改造主要是重构抗体和表面重塑抗体。 并不是整个 CDR 都参与抗原的特异性识别，在 CDR 区中仅一部分氨基酸残基与抗原结合，这些氨基酸残基决定抗体的特异性，被称之 SDR。SDR 移植抗体仅将异源抗体 CDR 区内与抗原结合关系密切的 SDR，移植到人抗体相应位置上，使人源化抗体的免疫原性进一步降低。 SDR 移植抗体往往存在亲和力和特异性降低的缺点。目前重构抗体是对鼠源性单抗人源化改造最常用、最基本的方法。表面重塑抗体是对鼠抗体框架区表面氨基酸的残基进行重塑或替换，该技术仅改造或替换与人抗体有明显差异的表面氨基酸的残基。 在维持抗体活性和减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸残基替换，使抗体与抗原结合具有更好的亲和力和特异性。 ．噬菌体抗体库技术 噬菌体抗体库技术是迄今发展最成熟、应用最广泛的抗体库技术。 它是一种基因表达产物和亲和选择相结合的技术建立在噬菌体外壳具有表达抗体蛋白片段能力的基础上，以改构的噬菌体为载体，用基因工程技术克隆人抗体可变区的全套基因,然后将克隆的基因插入噬菌体编码衣壳蛋白的基因中,这样在噬菌体表面表达特定抗体片段,而在噬菌体核心DNA中则含有该抗体片段的基因建立噬菌体抗体文库形成获得一个具有上亿个体外方式制得的不同抗体的基因数据库。 抗体的具体制备方法是将抗原包被在固介质上,加入待筛选的噬菌体颗粒与固定的抗原结合,获取结合的抗体,将未结合的抗体洗脱,从噬菌体库中筛选出针对特定抗原的特异性抗体的可变区。用表达有相应抗体分子的噬菌体颗粒去感染宿主菌,使该噬菌体颗粒得到扩增。将抗体可变区与恒定区组合得到具有完整能的全人单克隆抗体。 噬菌体展示技术的最大优点是一旦噬菌体库建立后,就可以根据需要直接从文库中筛选得到针对目标抗原的特异性抗体,大大缩短了单克隆抗体的制备周期得到的抗体可用于制备完全人源化抗体。当抗体分离出来时,噬菌体系统同时也提供了设计抗体亲和性及其应用的模式。 但是该技术也存在一定的缺陷,由于受表达系统的限制,抗体库的库容不足以支持获得稀有的抗体,难以涵盖一些动物抗体的多样性; 而且对噬菌体或表达宿主的生长或功能产生抑制作用的抗体也难以获得非免疫抗体库获得的抗体亲和力不高; 在淘选过程中会出现高 亲和力低拷贝的特异性噬菌体抗体的丢失等。 ． 核糖体展示技术 核糖体展示技术是一种完全在体外合成并筛选蛋白质的无细胞转化技术。 该技术建立不受细胞转染和表达等因素影响的完全体外展示系统利用聚合酶链反应扩增含目的基因的 cDNA 文库，同时引入启动子、核糖体结合位点及茎环结构，在转录/翻译耦联系统作用下，形成“蛋白质-核糖体-mR