实验四ywh-2013线粒体先做.ppt

清点物品（4人组为单位） 手术器材：剪刀2、镊子2、止血钳1、解剖针1 推片2片 蜡盘、小平皿、大头针、纱布等 载片若干（浸于酒精中） 每组取出约20片置于平铺的纱布上，晾干备用。 试剂： 染液：甲基绿一哌洛宁混合液、中性红染液、 詹纳斯绿B染液、0.1％碱性固绿 Ringer氏液(两栖类用)、0.9%NaCl （哺乳类用）、70%乙醇 实验Ⅲ 实验六 细胞组分的化学反应 实验七 液泡系的活体染色 实验八 线粒体的活体染色 实验用品 一、材料和标本： 蟾蜍（每组一只）、兔子一只 二、器材和仪器 光学显微镜、解剖器材、推片、蜡盘、大头针、载玻片、盖片、小平皿、吸水纸、记号笔、废液缸、吸管 恒温水浴箱、20ml注射器 三、试剂 甲基绿一哌洛宁混合液、 70％乙醇、5％三氯醋酸、0.1％碱性固绿 l/3000中性红染液、0.65%Ringer氏液(两栖类用) l/300詹纳斯绿B染液、0.9%NaCl(哺乳类用生理盐水) 实验六 细胞组分的化学反应 实验目的： 1.了解核酸、蛋白质等细胞化学反应的原理 2.掌握细胞中DNA、RNA、碱性蛋白的细胞化学染色方法 实验原理 实 验 内 容 一、Brachet反应—— 显示细胞内的DNA和RNA 二、细胞内碱性蛋白的显示 一、Brachet反应—— 显示细胞内的DNA和RNA 实验原理： 细胞经甲基绿-哌洛宁混合染液处理后，其中的DNA和RNA出现不同的呈色反应。 甲基绿：与聚合程度较高的DNA亲合力高， 呈蓝绿色 哌洛宁：与聚合程度较低的RNA亲合力高， 呈浅红色 因此，可用Brachet反应对细胞中的DNA和RNA进行定位、定性分析。 实 验 方 法 取蟾蜍心脏血，每组（4人一组）制备4张血涂片 室温晾干血涂片，在正面作好标记 浸入70%乙醇中，固定5~10min，取出晾干 取2张涂片，滴加甲基绿-哌洛宁2~3滴，染色30min 清水洗去染液，吸去水分（不要吸得过干） 放入丙酮中分色2～3秒钟，水洗，吸去水分 镜检并记录结果 实验原理 标本经三氯醋酸处理抽提掉核酸后，再用不同pH值的固绿染液分别染色，使细胞内的酸性蛋白和碱性蛋白质显示出来。 碱性蛋白（生理条件下带有正电荷）的显示用碱性固绿 pH8.0～8.5 带负电荷 实验方法 1．取另2张已用乙醇固定并晾干的血涂片 2．浸入5％三氯醋酸中，60℃处理30min，抽提出核酸 3．清水反复冲洗3min以上（冲洗背面）, 以冲去三氯醋酸痕迹(染色成功的关键) 4. 吸干水分 4. 滴加0.1％碱性固绿2~3滴，染色15分钟 5．清水冲洗，吸去多余水分，镜检。 碱性固绿染色结果 胞质、核仁不着色 细胞核大部分被染成绿色，是为碱性蛋白质存在处。 实验五注意事项 每组同时制备4张血涂片，乙醇固定、晾干后： 2张——Brachet反应 2张——细胞内碱性蛋白的显示 一定要用不同的记号作好标记！ 实验六 液泡系的活体染色 实验目的 掌握一种活体染色方法； 了解光镜下液泡系的基本形态结构。 实验原理 液泡系,又称内膜系统。 软骨细胞能合成与分泌软骨粘蛋白及胶原纤维等,因而液泡系发达,含发达的RER和Gc。 中性红是液泡系特殊的活体染色剂。在细胞处于生活状态时，中性红只将液泡系染成红色，细胞质及核不被染色。中性红染色可能与液泡中的蛋白有关。 实验方法 1.取蟾蜍胸骨剑突软骨最薄部分的一小片，放在载片上。 2.加1～2滴1/3000中性红染液（一定要没过剑突软骨），染色8～lO分钟。 3.用吸水纸吸去染液,加一滴0.65%Ringer氏液，盖上盖片，吸去多余液体。 4.镜检。 结果： 显微镜下观察,可见软骨细胞为椭圆形,细胞核周围有许多被染成玫瑰红色、大小不一的小泡，即软骨细胞液泡系。 实验七 线粒体的活体染色 实验目的 掌握线粒体的活体染色原理及方法； 熟悉空气栓塞法处死兔子的方法； 了解光镜下线粒体的基本形态结构。 实验原理 活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。 本次实验所用的活体染色剂 中性红：液泡系的专一性活体染色剂 詹纳斯绿B：线粒体的专一性活体染色剂 实验方法 1. 空气栓塞法处死兔子，置于解剖盘内。 注意事项 注射部位不能过于靠近耳根 向心端注射，针孔朝上 注射前先抽好空气 针尖探入近1cm后，左手拇指固定住针尖，右手后移，将针筒中空气迅速推入静脉中。 注射完毕，立即将家兔放在地上进行观察 针筒、针头冲洗干净 4. 每人取兔肝边缘较薄的肝组织一块（约2～3mm3大小） 放入平皿内，滴加0.9%NaCl 用镊子轻压，洗去