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第15章 流式细胞术 概念 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM） 是一种利用流式细胞仪对生物细胞的理化特性和生物学特性进行多参数定量分析，和对特定细胞群体分选的技术。 第一节 流式细胞术的基本原理 流式细胞仪特点 X--激发光源 单波长、高强度、高稳定性 多采用氩离子（488nm）激光器或氦氖（633）激光器 一般选配2-4根激光，488nm、633nm和355nm、407nmUV激光 最多检测13个荧光参数 细胞分选系统 细胞分选的原理 细胞分选(cell sorting)：是将特定的细胞从细胞群体中分离出来。 (二) 检测参数 参数 数据的显示方式 检测信号 细胞受到激发光的照射时，产生了细胞的散射光和荧光信号。 (1) 检测信号之一：散射光信号 前向散射光（Forward scatter, FS）信号 侧向散射光（Side scatter, SS）信号 (2)信号检测之二--荧光信号 细胞荧光信号测定 外周血淋巴细胞样品的制备 分离单个核细胞 培养细胞的样品制备 蛋白酶消化 机械吹打 使贴壁细胞脱落 洗涤 尼龙网过滤 新鲜实体组织单细胞悬液的制备 机械法 酶处理法 化学试剂处理法 表面活性剂处理法 抗体使用原则 根据仪器型号和抗原表达强弱合理选择荧光抗体 低表达抗原标记高S/N（信噪比）荧光素，如PE 高表达的，FITC适用 抗体标记的方法 如何选择流式细胞仪测荧光染料 ???依据FCM的激光光源发射光波长做为重点考虑。 如：氩离子气体激光管,它的发射光波488 nm； ????????氦氖离子气体激光管发射光波长633 nm； ??????????????? ?488 nm激光光源常用的荧光染料有 FITC ??????????????? PE ??????????????? PI ????????????????CY5 ??????????????? preCP ??????????????? ECD等。 ? 激发光波长（ηm） 发射光峰值（ηm） FITC 488 525（绿） PE 488 575（橙红） PI 488 630（橙红） ECD 488 610（红） CY5 488 675（深红） PreCP 488 675（深红） 2.数据收集 参数：即每一种测量信号 参数种类： 两个散射光参数：FS和SS 通常三种荧光参数：绿、橙、红 Gate设置：选定散点图中的指定一个区域，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群对其参数进行分析。 数据显示方式 单参数测量数据的显示和分析； 双参数测量数据的显示和分析； 多参数测量数据的显示和分析。 由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。 双参数直方图： 纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞的相关信息。 多参数测量数据的显示和分析 显示方式：采用若干个分布直方图和各种不同组合的双参数数据显示信息。 设门分析:显示该区域细胞的相关生物学信息。 光谱交叉 荧光补偿（fluorescence compensation）方法 流式细胞术分析的质量控制 ◆仪器的质量控制 ◆免疫荧光对照 设阳性、阴性对照 ◆双色荧光和多色荧光分析中的荧光补偿 ◆试剂和操作的标准化 第 三 节 流式细胞术的应用 流式细胞仪检测范围 细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 细 胞 周 期 分 析 细胞周期 样品制备 细胞凋亡分析 Annexin V/PI double staining 小 结 流式细胞仪的工作原理。 数据的显示与分析。 流式细胞术的应用。 保证细胞数量：105-106 荧光免疫标记方法 直接法（多用） 间接法 设门分析技术( gating analysis ) 门的形状：线性门、矩形门、圆形门、多边形门、十字门、任意形状门。 （一）单参数直方图 细胞相对数量 信道(channel ) 单参数直方图 单参数直方图（Histogra