第七章2转化转导结合菌种包藏.pptVIP

第三节 基因重组 定义：凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组（gene recombination）或遗传重组。 基因重组的意义 基因重组是杂交育种的理论基础。 杂交育种的优点：①由于杂交育种选用了已知性状的供体菌和受体菌作为亲本，因此，不论在方向性还是自觉性方面，均比诱变育种前进了一大步。 ②利用杂交育种往往还可以消除某一菌株在经过长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象，因此，它是一种重要的育种手段。 杂交育种的缺点：由于杂交育种的方法较复杂，工作进展较慢，还很难像诱变育种技术那样得到普遍的推广和使用，尤其在原核生物的领域中，应用转化、转导或接合等重组技术来培育可应用于生产实践上的高产菌株的例子还不多见。到了70年代后期，由于原生质体融合技术获得巨大的成功后，才使重组育种技术获得了飞速的发展。 一、原核微生物的基因重组 基因重组的方式： 转化 转导 接合 原生质体融合 感受态： 出现时间：只在细菌生长的某一时期出现；不同菌种的感受态出现在不同生长时期 Streptococcus pneumoniae的感受态出现在生长曲线中的指数期的中期， Bacillus的一些种则往往出现在指数期末及稳定期的初期。 感受态细胞的比例：当处于感受态高峰时，群体中呈感受态的细胞因菌种而不同. Bacillus subtilis不超过10~15% Streptococcus pneumonia和Haemophilus influenzae（流感嗜血杆菌）达到100% 转化DNA的最低浓度：在群体中含有15%感受态细胞时，0.1?gDNA/ml细胞悬液即可有效发生转化 转化因子： 转化因子：本质是供体DNA片段 一般的转化因子都是线状双链DNA；也有少数报道认为线状单链DNA也有转化作用。 大小：经过多次提纯操作后，每一转化DNA片段的分子量都小于1×107，即约占细菌核染色体组的0.3%，其上平均约含15个基因。而粗制的DNA则分子量较大。 吸收数量：每个感受态细胞约可掺入10个转化因子。 转化频率：一般只有0.1~1%，最高时亦达10%左右。据研究，呈质粒形式（双链闭合环状）的转化因子，其转化频率最高（因为它进入受体菌中后，可不必与受体染色体进行交换、整合即可进行复制和表达）；。 .转化的过程 以S. Pneumonia strr（肺炎链球菌抗链霉素菌株）为例，大致可分为六阶段： 吸附：双链DNA片段与细胞表面的特定位点结合，此时，细胞膜上的胆碱可促进这一过程。 切割：在吸附位点上的DNA被核酸内切酶分解，形成平均分子量为4~5×106的DNA片段； 入胞：DNA双链中的一条单链被膜上的另一种核酸酶切除，另一条单链逐步进入细胞，这是一个耗能的过程。分子量小于5×105的DNA片段不能进入细胞。这时如用低浓度溶菌酶处理，因它提高了细胞壁的通透性，故可提高转化频率； 重组：来自供体菌的单链DNA片段在细胞内与受体细胞核染色体组上的同源区配对，交换、整合和取代，于是形成了一个杂合DNA区段。在这一过程中，有核酸酶、DNA聚合酶和DNA连接酶的参与； 复制：受体菌的染色体组进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一获得了供体菌的转化基因，另一个未获供体基因； 转化子形成：当细胞发生分裂后，一个子细胞含供体基因，这就是转化子；另一个细胞与原始受体菌一样。 4.转染 定义：把噬菌体或其它病毒的DNA（或RNA）抽提出来，让它去感染感受态的宿主细胞，并进而产生正常的噬菌体或病毒的后代，这种现象称为转染。 与转化的区别： 病毒或噬菌体并非遗传基因的供体菌 中间不发生任何遗传因子的交换或整合 最后不产生具有杂种性质的转化子 （二）接合（conjugation） 定义：供体菌（“雄”）通过其性菌毛与受体菌（“雌”）相接触，前者传递不同长度的DNA给后者，并在后者细胞中进行双链化或进一步与核染色体发生交换、整合，从而使后者获得供体菌的遗传性状的现象，称为接合。 通过接合而获得新性状的受体细胞就是接合子（conjugant） 存在范围： 细菌：G – 较为多见如E. coli、Salmonella、Shigella、Serratia、Vibrio 、Azotobacter 、Klebsiella和Pseudomonas等最为常见 放线菌：Streptomyces 、Nocardia 接合还可发生在不同属的菌种之间， 研究细菌接合方法的基本原理 接合的一般过程： 接合时F+细胞与F– 细胞相遇，性菌毛与F– 细胞表面发生吸附而形成接合管； F+细胞内，F因子的一条DNA单链在特定的位点上发生断裂；断裂后的单链逐步解开，同时以另一条留存的环状单链做模板，通过模板的滚动，一方面把解开的单链以5’为先