流式细胞仪讲义1.pptVIP

流式细胞仪原理及其应用 抗体标记的方法 抗体选择 首选直接标记抗体 荧光分子 PE最强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原 间接标记：适用范围广, biotin-avidin不适合 弱抗原的检测 实验对照的设计 空白对照： 阴性对照：常用同型抗体对照 单色分析：设同型抗体对照 多色分析：同型对照，单阳性对照（用于仪器校正） 阳性对照：检测阴性时 应 用 细胞表面标志 细胞内离子浓度 细胞核DNA含量 细胞分选 空白对照和阴性对照的比较： 去除非特异性结合 染色的基本步骤 免洗全血细胞染色步骤： 周期分析细胞染色步骤： 其他细胞分析染色步骤： 上机分析 上机的基本步骤 仪器校正：以监测Flow-Check Fluorospheres的CV 值来校正仪器CV, CV≤ 2 选择信号放大方式：线性放大；对数放大。 根据需要选择 阈值设定：取决于细胞碎片多少，一般为100 上机采样注意事项 对照组荧光道数的确定： 采样数目的多少：10000—100000个细胞 采样速度的确定：300----1000个细胞/秒 喷嘴是否堵塞： 喷出的液柱是否垂直： 流式细胞仪数据表达方式 数据存储: LIST MODE 数据显示: 直方图 ( Histogram ) 二维点图(Dot Plot) 等高线图(Contour Plot) 密度图 (Density)等 直方图分析 外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后） 等高图和密度图分析 散点图分析 * * 流式细胞术的基本概念 流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是对处于快速、直线流动状态中的细胞或生物颗粒膜表面及内部化学成分快速进行多参数、定量、定性和分选的技术。 研究对象 生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等 流式细胞仪的特点 单个细胞分析 同时多参数分析 速度快：10000个细胞/秒 统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况 分选感兴趣的细胞 流式细胞仪的基本原理 流式细胞仪 是集激光技术、电子物理技术光电测量技术、电子计算机技术及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术于一身的新型高科技仪器。 流式细胞仪仪器结构 液流系统 光学系统 激光光源 光收集系统 电子系统 光电转换 数据处理系统 细胞分选系统 流式细胞仪的液流系统 Injector Tip Fluorescence signals Focused laser beam Sheath fluid 流式细胞仪的光学系统 激光 (Laser)是一种相干光源，它能提供单一波长、单一方向、同步的稳定光照 激光波长: 从红外到紫外光可调节 光收集系统是由若干组透镜, 滤波片, 小孔组成，将产生的光信号引导至检测器 散射光信号 前向角散射光（FSC, Forward Scatter） 入射激光前方的散射光信号 检测 细胞相对大小及其表面积 侧向角散射（SSC, Side Scatter） 与入射激光成90?角的散射光信号 检测 细胞及细胞内相对复杂的粒度 流式细胞仪的光学系统 激发光源与荧光标记物 Forward Angle Light Scatter 前向角 FALS Sensor Laser 90 Degree Light Scatter 90度侧向角 FALS Sensor 90LS Sensor Laser PMT PMT PMT PMT Dichroic Filters Bandpass Filters 光收集系统原理 Laser 1 2 3 4 流式细胞仪的电子系统 可进行信号检测和分析 当细胞携带荧光素标记物, 通过激光照射区 时, 受到激发, 产生不同波长的、代表细胞内不同物质的荧光信号 荧光信号由光电接收器接收，转变为电信号，可分析电压脉冲的高度、面积和宽度 电脉冲信号经A/D转换成数字信号 数字信号传送到计算机，进行储存、 作图、 统计分析 流式细胞仪的检测范围 细胞结构 细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 细胞功能 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体 血液成分的分析：如