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小麦萌发前后淀粉酶活性的比较 一、实验目的及要求： 1，学习分光光度法测定酶活力的原理与方法； 2，了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。 二、实验的基本原理 淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称。实验证明，在某些植物如小麦、大麦的休眠种子中只含有β–淀粉酶，α -淀粉酶是在发芽过程中形成的，所以在禾谷类萌发的种子和幼苗中，这两类淀粉酶都存在。其活性随萌发时间的延长而增高。 本实验以淀粉酶催化淀粉生成麦芽糖的速度来测定酶的活力。麦芽糖是还原性糖，能使3，5-二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基5-硝基水杨酸，后者在500 nm处有最大吸光度，而进行定量测定。 三、主要仪器设备及实验耗材： 小麦种子、可见分光光度计、离心机、恒温水浴，研钵等。 标准麦芽糖、0.2%淀粉、3，5----二硝基水杨酸溶液、1%氯化钠溶液、0.02 mol/L 磷酸缓冲液、石英沙。 四、实验内容或步骤： 1．麦芽糖标准曲线制作 取 7 支干净的具塞刻度试管，编号，按表 35 – 1 加入试剂： 表 1 制作麦芽糖标准曲线配方表 2、萌发小麦种子 浸泡小麦种子24h ，入25°C恒温箱或在室温下发芽。 3、提取小麦萌发前后的酶液 （1）幼苗酶的提取：取萌发的幼苗10株，入研钵加石英砂0.2 g，1 % NaCl 3 ml，研磨成匀浆，0-4 °C下放置20 min。 离心，2000 r/min 10 min .测定上清酶液的总体积。 （2）种子酶的提取：取干燥种子10粒作对照，操作方法同上。 4、二硝基水杨酸法测定酶活力 量取待测酶液1 ml，pH6.9的0.02mol/L磷酸缓冲液稀释10倍，作为酶活力测定物。取6根试管按下表加各物质：表2 ５、计算酶活力单位 总酶活力单位= (C酶—C0)× n × V酶 式中： C酶为种子酶或幼苗酶分解淀粉产生的麦芽糖的浓度（mg/ml）； C0为表2中空白管的麦芽糖浓度； n为酶溶液稀释的倍数； V酶为提取酶液的总体积（ml）。 设在40 °C、pH 6.9的条件下，3 min内水解淀粉释放1 mg麦芽糖所需要的酶量为1个活力单位（U）。 五、思考题 1、为什么提取酶液的过程应该在0-4 ℃下进行？测定淀粉酶活性时为什么要在40 ℃条件下水解淀粉？ 2、小麦萌发过程中淀粉酶活性升高的原因和意义是什么？ * * 7 6 5 4 3 2 1 2 2 2 2 2 2 2 3,5-二硝基水杨酸 0 0.4 0.8 1.2 1.6 1.8 2.0 蒸馏水（ml） 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0.2 0 麦芽糖标准液（ml） 管号 试剂 摇匀摇匀，置于沸水浴中煮沸 5 min 。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至 20 m L 。以 1 号管作为空白调零点，在 500 nm 波长下比色测定。以麦芽糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。 -- 0.5 0.5 V(稀释酶液)/ml 0.5 -- -- V(蒸馏水)/ml 1 1 1 V（0.2﹪淀粉溶液）/ml 5/6（空白管） 3/4（幼苗酶稀释液） 1/2（种子酶稀释液） 试管编号 试剂 混匀各管，40 °C恒温水浴，水解3 min， 加入1% 3，5-二硝基水杨酸溶液2 ml。入沸水浴，准确加热5 min，迅速冷却至室温，加水稀释至20 ml，混匀。 测定各管的A500nm值 *