荧光定量PCR技术讲座..pptVIP

* * * * * * * * *  SYBR Green法实验流程 样本处理 RNA提取 qPCR 数据分析 逆转录 样本处理与RNA提取 外界刺激 –10min – 可检测的表达改变 样品离开定义环境 –2min– 裂解、固定细胞 TRIzon(苯酚、盐酸胍) 裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸呱， SDS） 液氮 RNA保存液 小心DNA污染！ 使用DNase 以RNA作PCR阴性对照 CW0580 CW0592 逆转录 逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ 剪接体是否会有二级结构干扰？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？ RT-PCR一步法还是两步法？ 两步法： 步骤多但灵活多样。cDNA可长期保留检 测多个基因。便于反应优化。 推荐：工作的初期阶段 RealSYBR 二步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX RealSYBR 一步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX RealSuper 二步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX 一步法：简便、快捷但只做一个基因，一旦失败 难以查找原因。 推荐：工作的成熟阶段 RealSuper 一步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX 内参基因选