激酶调控缺氧引发的结肠癌耐药机制研究2.docx

高通量RNAi筛选鉴定缺氧介导的大肠癌化疗耐受的激酶调控网络项目的研究目标，研究内容，以及拟解决的关键问题研究目标针对缺氧引起的结肠癌细胞对化疗治疗的耐受，选取p53缺失的肿瘤细胞系，高通量沉默人基因组所有激酶和激酶，探究缺氧导致的结肠癌治疗耐受的作用机制，为寻找在缺氧耐受结肠癌治疗中的新靶点提供理论依据；通过对临床结肠癌样本中的缺氧区域的目的基因表达高低的分析，阐明其表达和结肠癌预后的相关性，为结肠癌个体化医疗提供理论基础。研究内容一）缺氧和肿瘤治疗的细胞研究模型建立1，药物刺激模拟缺氧：使用药物DFO（10 mM）和DMOG（1 mM）处理HCT116 p53-/-细胞，模拟缺氧环境，检测HIF-1a上调；2，HCT116 P53-/-细胞中过表达HIF-1a持续激活突变体（Dm HIF-1a），模拟缺氧刺激；3，药物刺激和过表达HIF-1a突变体，联合化疗处理，MTT和流式细胞术检测HCT116 P53-/-细胞系的存活和凋亡；二）高通量沉默人激酶组，检测其对缺氧引起的肿瘤治疗耐受的影响1，使用人激酶shRNA慢病毒文库（已构建完成），沉默人基因组中所有激酶，MTT检测其在缺氧处理情况下对肿瘤化疗处理的影响；2，针对MTT筛选中得到的阳性作用shRNA病毒，使用Annexin 5试剂盒检测细胞凋亡，流式细胞术检测细胞周期变化；3，WB检测缺氧联合肿瘤化疗处理情况下，沉默阳性作用基因后，Caspase-3的激活；三）动物水平检测阳性激酶沉默对缺氧情况下肿瘤生长以及药物反应的影响1，选取不超过3个阳性激酶，构建过表达和基因沉默稳定株；2，裸鼠成瘤实验，检测过表达/基因沉默对肿瘤生长的影响；3，缺氧刺激下，检测过表达/基因沉默对肿瘤生长以及肿瘤治疗的影响四）临床验证细胞和动物水平检测数据1，收集不少于200例肿瘤样本，使用缺氧标志物，CA IX，检测肿瘤标本中缺氧区域目的激酶的表达高低；2，统计激酶和缺氧标志物表达高低与肿瘤预后的关系拟解决的关键问题1，虽然缺氧引起肿瘤治疗的耐受，但其机制仍然不清楚，HIF介导的基因转录调控网络是主要因素。HIF可以直接或间接调控近千个基因的表达，然而目前的研究多集中在对单个基因的功能探索，少见系统性研究缺氧刺激下基因调控网络的功能；2，激酶在HIF介导的肿瘤治疗耐受中起重要作用，但未见系统性探究激酶在缺氧引起的肿瘤治疗耐受中的作用；3，虽然存在系统性探究缺氧刺激下基因表达调控网络的工作，但通过高通量RNAi方法系统性沉默基因群，直接探究其功能的工作，尚处于空白。三）拟采用的研究方案及可行性分析研究方法1，高通量激酶shRNA慢病毒文库构建（已完成）：使用慢病毒质粒载体，构建基于 62 bp的shRNA克隆，并使用96孔高通量病毒包装系统，在293T细胞中高通量包装激酶shRNA慢病毒；2， MTT和流式细胞术检测肿瘤细胞化疗处理下的细胞存活以及细胞周期和凋亡；3， WB检测基因的表达和活化；4，裸鼠成瘤实验检测不同药物刺激和基因功能改造情况下，肿瘤生长的影响；5，免疫组化检测临床肿瘤样本的缺氧、凋亡指标四）本项目的特色和创新之处1，研究方法的创新性：系统性探究基因在缺氧环境下对肿瘤治疗耐受的影响，国内外未见研究报道，部分系统性的研究工作基于针对HIF信号通路的下游调控网络的芯片表达谱分析，未见系统性功能研究。本项目将在国际上首次通过构建高通量shRNA慢病毒文库、并结合人临床结肠癌病例样本分析，探索人激酶在缺氧引起的肿瘤治疗耐受中的作用与分子机理，其成果对于理解缺氧引起的肿瘤治疗耐受有重要意义，并为将来的临床治疗提供重要靶点。 2.立题的新颖性：激酶在肿瘤发生中发挥重要作用，已经产生海量研究数据，但在缺氧环境下，系统性探究激酶对肿瘤生长和治疗的影响，尚处于空白。基于缺氧是肿瘤组织中一个普遍存在的现象，我们的工作将在国际上首次阐明激酶组学在缺氧引起的肿瘤耐受中的作用和机制。五）年度研究计划和预期研究结果研究内容预期目标第一年1，选择p53缺失结肠癌细胞系，药物和基因干预模拟缺氧环境，探究缺氧和肿瘤治疗的关系2，摸索高通量RNAi筛选的条件，包括慢病毒用量，检测时间等1，确认缺氧诱导肿瘤治疗耐受的表型2，建立缺氧模拟的药物和基因干预模型3，优化高通量RNAi筛选条件第二年1，缺氧联合肿瘤化疗处理条件下，进行高通量RNAi筛选2，探究阳性作用基因的功能机制，分析凋亡、增殖信号通路变化3，裸鼠成瘤实验，分析干预阳性作用基因后，药物处理或者未处理条件下肿瘤生长情况1，筛选得到一批缺氧条件下影响肿瘤药物疗效的基因2，阐明目的基因的作用机制3，动物水平验证目的基因的表型第三年1，免疫组化检测临床样本目的基因的表达谱，分析其与缺氧、肿瘤预后的相关性2，分析数据，撰写文章，完成成果鉴定1，预计得到一