液相色谱讲稿.ppt

实用高效液相色谱方法的建立 沈 菁 湖北省农科院质标所 myshenjing@126.com 介绍你们的工作 使用的液相色谱仪型号？ 仪器配置：泵？检测器？ 从事行业？ 常量分析、痕量分析或跟踪？ 用到哪一类HPLC方法 方法来源？ 开发过方法？ 主要内容 HPLC基本知识 方法建立的步骤 色谱法的分离原理 溶于流动相中的各组分经过固定相时，由于与固定相发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。 HPLC的分类 正相色谱 (NP-HPLC) 反相色谱 (RP-HPLC) 反相离子对色谱 (RPIC) 离子交换色谱 (IEC) 空间排阻色谱 (SEC) 手性化合物分离模式(Chiral separation mode) HPLC的特点 HPLC具有分离效率高、分析速度快和应用范围广等特点 适合于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分离分析 应用 已成为化学、生化、医学、工业、农业、环保、商检和法检等学科领域中重要的分离技术 我国药典收载HPLC项目和数量比较表 农药产品标准中分析方法选择的趋势 由气相改液相：毒死蜱、三唑磷等 由光度法改液相：百草枯、草甘膦等 HPLC方法建立的步骤 目前，在大多数的实验室，HPLC方法的建立仍在靠经验进行。 避免随意的“试验—错误”法。 对每次试验进行设计，以获得有用的信息 1.有关样品成分和性质的重要情况 所含化合物的数目 化合物的化学结构（官能团） 化合物的分子量 化合物的pKa值 化合物的UV光谱图---检测器选择 样品基质的性质：溶剂，填充物等----是否需要前处理 化合物在有关样品中的浓度范围 样品的溶解度-----流动相的兼容性 明确分离目的 主要目的是分析还是回收样品组分？ 是否已知样品所有成分的化学特性，或是否需定性分析？ 是否解析出样品的所有成分？ 如需定量分析，需精密度多高？ 本法用于几种样品剂型（原料、制剂、环保样品等）？需要一种以上的HPLC方法吗？ 本法将仅用于分析几种样品，还是许多种？ 将使用最终方法的常规实验室中，已有哪些HPLC设备和技术？ 2.样品的性质和需要的预处理 可直接进样的溶液 需稀释、缓冲pH或添加另一液体的溶液 能在流动相中溶解的固体 含有干扰物质或“损柱剂”而必须在进样前将其去除的溶液 含有不溶性赋形剂的混合物 敌百虫的水解反应 3.检测 尽量使用UV检测器 二极管阵列 示差折光 荧光 电化学 柱前或柱后衍生化 紫外吸收曲线 一种化合物，使其峰的最大吸收值理想，可用该公式估计其最小的重量wm 加强UV检测能力 4.开始分离 针对所测样品选择最有希望的HPLC方法和一支适宜的色谱柱 适于不同样品的较好HPLC方法和色谱柱 高效氯氰菊酯—立体异构体 精喹禾灵—光学异构体 草甘膦（酸）—阴离子 百草枯—阳离子化合物 主要HPLC方法的特性 次要HPLC方法的特性 选用反相：进第一个样品 流动相的比例？ 选溶剂强度适中的等度流动相：至少有可能使某些化合物流出且具有合理的保留时间 用强度大的等度流动相（如100%有机相），然后以20%比例递减有机相比例 采用梯度洗脱法分离最初样品 必要时选择缓冲液 HPLC方法建立的目标 所有色谱峰间合适的分离度：Rs≥2.0 适当的保留：1≤k≤10.5 如：分离时间在5~10min 良好的方法耐用性与适应性 定量：含量测定≤2%（RSD） 要求不高的或痕量分析5% 压力：最好150bar 峰高：最好为信噪比大的窄峰 流动相尽可能简单，溶剂消耗少 R=1.5 达基线分离 色谱基础：分离度公式 分离度影响因素 理论塔板数N：最容易提升的因素 选择因子α：对分离度的影响最大 容量因子k’ 改变键合相 改变流动相 小结：先优化k’，再α，最后优化N，便可改变测定条件 分离度与溶剂强度的关系 避免k’1:可能有干扰峰，基线经常不好，使定量困难 k’增大，操作时间延长，谱峰展宽，将使定量难以准确 要适中 建立方法之初，应测出k’范围 5.优化条件 如果改变选择性，首选改变流动相 流动相的比例 流动相的种类 流动相pH 其次是改变键合相品牌或种类——色谱柱 改变流动相比例 改变流动相种类 等强度的溶剂混合对分离的改善—三元体系 改变流动相pH 酸 HA H++A- (电中性) (带电) 碱 B BH++OH- (电中性) (带电) 离子对HPLC中的溶剂优化 通过改变离子对