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活性氧检测试剂盒 Reactive oxygen species assay kit 使用说明 货号 ：CA1410 规格 ：100-500T 产品内容 ： 10 mM DCFH-DA in DMSO 0.1 ml −20 ºC 保存 活性氧供体 1 ml −20 ºC 保存 说明书 1 份 产品简介 ： 活性氧 (Reactive oxygen species, ROS) 包括超氧 自由基、 过氧化氢、 及其下游产物过氧化物和羟化物 (O2• − ,H2O2, •OH, ONOO − , •NO)等， 参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。采用 2,7-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA)是迄今最常用、最灵敏的细 胞 内活 性 氧 检 探 针 。DCFH-DA 没 有 荧 光 ，进 入 细 胞 后 被 酯 酶 水 解 为 dichlorofluorescin (DCFH)。在活性氧存在时 DCFH 被氧化为不能透过细胞 膜的强绿色荧光物质 dichlorofluorescein (DCF)，其荧光在激发波长 502 nm，发射波长 530 nm 附近有最大波峰，强度与细胞内活性氧水平成正比。 此活性氧检测系统本底低，灵敏度高，重复性好，操作简便。 本试剂盒适于荧光显微镜、激光共聚焦显微镜等图像检测，荧光分光光 度计、荧光酶标仪、流式细胞仪定量 ROS 检测。 工作波长： 最佳激发波长 500、485 (500 ± 15 nm)，最佳发射波长 525 (530± 20nm)。也可按照 FITC 荧光检测条件检测。 操作步骤 ： 一 、 试剂准备 ： 1. DCFH-DA 可稀释于培养基或缓冲液中。 血清或培养基颜色并不影响 DCFH-DA 及细胞内荧光产生， 但可能会影响荧光显微镜观察，干扰荧光分光 光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪荧光测定。可将 DCFH-DA 稀释于无酚红培 养基或适宜的缓冲液如 PBS 中。这依赖于使用何种荧光设备进行测定。 2. 加入 DCFH-DA 的时机或孵育时间，以最终能顺利检测细胞内活性氧 为 目的。药物处理时间较短 (2 小时)或预计 ROS 效应较弱，可先加或同时 加入 DCFH-DA。反之，treat 刺激时间较长 (6 小时)或预计产生 ROS 效应 较强，可后加 DCFH-DA。 3. 活性氧供体含高纯度 12 mM H2O2。加入细胞后其本身即是一种活性 氧，而且在代谢过程中可产生其它类型的活性氧，均可使 DCFH-DA 氧化为 DCF 呈现强绿色荧光。因而，用户可使用该试剂作为测试实验系统或仪器的 阳性试剂，以初步观察细胞活性氧所产生的荧光的一般特征，并且也可以将 该实际作为实验的一个阳性对照。推荐该试剂的细胞工作浓度为 20~100 µM 或更低浓度，但超过 200µM 将产生细胞毒。如果用户熟悉 ROS 荧光或实验 没有必要采用阳性对照，可以不加该试剂。 二 、 加入荧光探针 ： 1. 加入 DCFH-DA 于培养基，推荐初始工作浓度为 10 µM。对不同的细 胞和处理，DCFH-DA 工作浓度可为 100 nM~20 µM，需进行预实验确定合适的 浓度。总体稀释倍数应在 1:500~1000 以上以避免 DMSO 对细胞的影响。以 DMSO 作为溶剂对照。 2. 37 ºC 孵育细胞 30min~至几个小时，通常 30-60min 即可。孵育时 间长短与细胞类型、刺激条件、DCFH-DA 浓度有关。 3. PBS 洗涤细胞 2 次。 三 、 荧光检测 采用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜图像检测照相，绿色荧光强度代表 活性