实时荧光定量PCR+技术的原理及其应用研究进展.pdfVIP

第%’ 卷第R 期 中 国 组 织 化 学 与 细 胞 化 学 杂 志 Z4@S %’S *4S R .2 年C 月 NT*KOK UVW#*+X VJ NTO3VNKDTO3#Y +*) Y3VNKDTO3#Y +?IS .2 实时荧光定量!# 技术的原理及其应用研究进展 赵焕英$ 包金风! （首都医科大学北京神经科学研究所，北京市神经再生修复重点实验室，教育部神经变性病重点实验室，北京$ %’( ） 〔关键词〕$ 实时荧光定量!# ；$ 荧光标记探针；$ )*+ 结合染料 〔中图分类号〕$ ,-./0 %$ $ 〔文献标识码〕$ + $ $ 自从 %(C/ 年 D?@@E; 发明聚合酶链式反应 %=7 ），报告基团发出的荧光能被淬灭基团所吸 （4@F7:9B;: 86BE= 9:B8GE4= ，!# ）以来，!# 技术 收，并依赖其较高的OP * 比值 （信1噪比，;EI=B@1 很快成为科研、临床诊断的热点技术。但是传统 G41=4E;: 9BGE4 ）和良好的辨别能力进行定量检测。 !# 技术在应用中一是不能准确定量，二是容易 %0 . 实时荧光定量!# 几个重要参数 交叉污染，产生假阳性。直到近年来荧光共振能量 !荧光域值 （G69:;64@ ）：以!# 反应的前%- 转 移 （ H@?49:;8:=8: 9:;4=B=8: :=:9IF G9B=;H:9 ， 个循环的荧光信号作为荧光本底信号，一般荧光域 J#K3 ）技术用于!# 定量后，上述问题才得到较 值定义为/ Q %- 个循环的荧光信号的标准偏差的 好的解决［%］。实时荧光定量!# （9:B@1GE7: H@?4941 % 倍。 G 值：也称循环阈值， 代表 F8@: ，G I:=:GE8 L?B=GEGBGEM: !# ，J,1!# ）是在!# 定性 代表G69:;64@ 。G 值是指样品管的荧光信号达到 技术基础上发展起来的核酸定量技术。它是一种在 某一固定阈值的!# 反应循环数。在!# 循环过 !# 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积 程中，即荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的 累实时监测整个!# 进程，最后通过标准曲线对 拐点所对应的循环次数。在实际操作中，这个时刻 未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了 也就是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值的 对)*+ 模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性 时刻，可见G 值取决于阈值。 #= ：是指模板 # $ 和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、 )*+ 的起始拷贝数 （图% 所示）。经数学证明，G 无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛 值与模板)*+ 的起始拷贝数 （#= ）成反比。典 $ 应用于分子生物学研究和医学研究等领域［. ］。 型的!# 分R 给阶段 （图. ）。 %0 实时荧光定量!# 技术的概述 %0 % 荧光共振能量转移原理 %((. 年NEI?86E 等首次提出了采用动态 !# 方法和封闭式检测方式对目的核酸数量进行定量分 析，荧光探针技术是基于标记基团的J#K3 原理而 实现的，当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基 团的吸收光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能 图%$ 实时荧光定量!# 几个重要参数 量可以从短波长 （高能量）的荧光基团传递到长波 JEIS %$ 36: E7