疟疾快速诊断技术.ppt

疟疾快速诊断技术的研究与应用 湖北CDC传染病所 袁方玉 主要内容 前言 显微镜镜检用于疟疾诊断 荧光显微镜用于疟疾诊断 PCR方法用于疟疾诊断 免疫学用于疟疾诊断 1、疟疾诊断试剂基于的靶抗原 2、诊断试剂基于的免疫学原理 3、疟疾诊断的快速诊断试剂 前言 疟疾是广泛分布于热带、亚热带及温带边缘地区的一 种重要蚊媒传染病，弓l起世界范围内的较高的发病率和死 亡率， 简便、快速和可靠的检测手段对提高临床疗效和控 制流行具有重要意义。传统的厚、薄血膜姬氏染色镜检浩 仍是当前疟疾诊断的主要方法，但费时费力，需专业培训 人员，且对低原虫血症者易漏诊 这些不足促进了更敏感、 简便，更快速的新技术的发展，如荧光染色镜检 组氨酸富 集蛋白和疟原虫乳酸脱氢酶抗原检测及PCR技术等。 世界卫生组织召开的专家研讨会上认为疟疾的诊断方法应准确、敏感、低廉快速方法应能检出每微升100个原虫，检测时间应在1小时内完成检测。 一、显微镜镜检用于疟疾诊断 显微镜镜检仍是目前广泛应用的疟疾诊断技术(金标准） 主要优点 - 特异高 - 能区分虫种 - 能分期 - 能计数 - 1小时内能完成诊断程序 缺点 要求有较高的技术素质 容易漏检（恶性疟） 大规模镜检费时、费力 敏感性低（原虫感染率为0.01%，厚片的敏感性是薄片的10倍） 二、 荧光显微镜用于疟疾诊断 研究发现，一些荧光素对核酸有好的亲 和力，经一定波长的紫外线激活，原虫核酸可通过荧光显微镜观察到。 目前常用的荧光染色剂: 有吖啶橙（AO） 苯并硫羟基嘌呤（bcp） 若丹明-123一种红色的荧光染料，主要作用于细胞膜，也常用于原虫染色 FIG. 1. Trophozoites of P. falciparum stained with AO in the QBC UV fluorescence method 吖啶橙（AO）优缺点： 染色需要较高的技术，辨认非特异性着色因子，特别注意区分豪厄尔斯氏体同原虫的区别，这种豪厄尔斯氏体来自溶血性贫血的病人。一般来说，吖啶橙染色法检测原虫的敏感性为41-93%,为﹥100原虫/1微升血液,相当于0.002%感染率。检测恶性疟的特异性为93%。检测间日疟和其他非恶性疟原虫的后期原虫的特异性只有52%。 ｂｃｐ染色优缺点： ｂｃｐ染色后疟原虫厚血膜在４００倍荧光显微镜下见，疟原虫各发育期及滋养体、裂殖体和配子体呈特异性苹果绿色荧光；胞桨疟色素呈黄色；白细胞胞桨染成亮绿色。血膜中的异物不呈荧光色，易区别。  FIG. 2. Trophozoites of P. falciparum stained with BCP in the fluorescence method.  ｂｃｐ染色恶性疟与间日疟血片，敏感性为９７．４％、９１．２％，特异性为６６．７％、５０％，阳性预测值９７．６％、８８．６％阴性预测值５０％与４０％。认为ｂｃｐ染色法是一种有使用价值的疟疾诊断新方法。 若丹明-123： 一种红色的荧光染料，主要作用于细胞膜，也常用于原虫染色 ，目前用得不多。 三、PCR方法用于疟疾诊断 PCR方法严格来说不能算是疟疾的快速诊断方法，他的主要特点是敏感性高，能检出每微升少于5个原虫的血液样本。复式、多层和荧光定量PCR方法可用于疟疾的定性和定量诊断，这对哪些形态学难以鉴别的样本来说非常有价值。 （一）疟原虫检测的常用的分子标志 有环子孢子 (CS)、18SrRNA片段、裂殖子表面蛋白一1(Msp一1)、裂殖子表面蛋白一2(Msp一2)及富组氨酸蛋白(m )基因等 CS是疟原虫子孢子表达的一种期特异性表面抗原的基因。已发现通过测定CS基因序列的重复结构可进行疟原虫分类．了解其遗传特征和地理来源。自1984对CSP基因序列进行测定以来，已积累了大量CSP基因资料，至今为止有中美洲、南美洲、东亚、东南亚、南太平洋岛屿开展间日疟原虫CSP基因序列分析．问日疟原虫CSP中央重复区由15—21个9肽重复单位组成，每单位由27个核苷酸编码9个氨基酸，目前已发现两类明显不同的9肽重复单位，分为Pv—I型和PV一Ⅱ型．I型按9肽单位氨基酸序列变化分为温带族和热带族，两族序列差异明显．分布有一定局限性。 （二）优缺点： PCR方法也可用于研究原虫的种群差异、突变和对药物的抗性 敏感性高。能够检测到感染率为0.00001%的恶性疟原虫血样，以及感染率为0.0000126%的间日疟血样。 利用套式和逆转录PCR方法能鉴定4种疟原虫， 一般PCR方法也存在着产物的污染易致假阳性，不能在一次检测