蛋白质的鉴定方法.docVIP

蛋白质的鉴定方法 1.双缩脲 NaOH，是Cu(OH)2 因为鉴定蛋白质的原理是，肽键在碱性条件下会和Cu离子发生反应，形成紫色络合物。 而Cu离子本身在碱性条件下会形成Cu（OH）2 蓝色沉淀。 双缩脲试剂A的成分是氢氧化钠的质量分数为0.1 g/mL的水溶液； 双缩脲试剂B的成分是硫酸铜的质量分数为0.01 g/mL的水溶液。斐林试剂是德国化学家斐林（Hermann von Fehling，1812年--1885年）在1849年发明的。它是由氢氧化钠的质量分数为0.1 g/mL的溶液和硫酸铜的质量分数为0.05 g/mL的溶液（其实还有酒石酸）所以，对比一下，就可以发现，要把硫酸铜溶液稀释 　　免疫印迹法 是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 ???? 2DE的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用 SDS－PAG分离，在二维平面上分开复杂蛋白混合物中的蛋白质。近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最具实用价值的核心方法。 ???? 染色 ???? 2DE分离后蛋白质的可视性是很重要的一步，不同的可视性技术的敏感度对后续实验的影响不同，即2DE结果须经过染色、脱色等处理方能检测分析。常用的染色方法有银染法、考马斯亮蓝染色法、无机盐负性染色法，另外还有以下几种染色试剂均可采用：丽春红S、氨基黑、印度墨水、35S硫脲银、胶态金、咪唑锌等。此外，亦有采用免疫抗体结合染色和放射性标记等方法检测蛋白。目前，没有一种蛋白染色法覆盖广泛的浓度和PI及分离后分析技术。其中银染法灵敏度较高，可达2～5μg，较考马斯亮蓝R－250高出约50～100倍，有利于蛋白质组复杂而微量蛋白成分的显示，因此银染法被广泛用于2DE分离后蛋白质点的染色，但对质谱测定有干扰，必须先脱银。 ???? 凝胶图像采集与分析 ???? 将染色蛋白的图像转化为电信号是进行蛋白斑点的定性和定量分析的关键步骤。满天星式的 2DE图像分析不能依靠本能的直觉，每一个图像上斑点的上调、下调及出现、消失，都可能在生理和病理状态下产生，必须依靠计算机为基础的数据处理，进行定性、定量分析。 ?????? 蛋白质质谱鉴定技术 ?采用质谱法鉴定经2DE分离后的交内蛋白质是目前蛋白质组研究中主要的支撑技术。目前，对于蛋白质组研究样品中的大量蛋白而言，通常的质谱分析分为两个层次。其一是以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI－TOF－MS）或电喷雾电离质谱（ESI－MS）为基础，进行高通量的蛋白和多肽质谱指纹分析，这一水平的分析结果中单一蛋白的信息含量低。其二应用质谱连用（MS/MS）进行低通量的蛋白和多肽片段的指纹分析，得到单一蛋白高信息含量的分析结果。 ???? 蛋白质组数据库 ? 蛋白质组数据库（Proteome database）被认为是蛋白质组知识的贮存库，它贮存了有机体、组织或细胞所表达的全部蛋白质信息，如蛋白质的顺序、核苷酸顺序、2D、3D结构、翻译后的修饰、基因组及代谢数据库等。目前瑞士日内瓦大学医院的蛋白质组数据库SWISS-2DPAG是最全面的。