氨基酸分析.docx

生物化学实验报告 姓 名： XXX 学 号： XXXXXXXXXX 专业年级： XXXXXXXXXXX 组 别： 第二实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称氨基酸的薄层层析实验日期2016-10-25实验地点第二实验室合作者指导老师评分教师签名批改日期 一、实验目的 1、掌握薄层层析法的一般原理。 2、掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。 3、掌握如何根据移动速率（Rf值）来鉴定被分离的物质（即氨基酸混合液）。 二、实验原理 1.薄层层析法是色谱分析技术的一种。 一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。（即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来） 硅胶吸附薄层层析： 吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶。硅胶：表达式为SiO2·XH2O。层析用硅胶是一种多孔性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极性硅醇基（－Si－OH），这种极性的硅醇基能和许多化合物形成氢键而产生吸附。 硅胶吸附薄层层析的特点： ① 硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活性也与含水量呈负性相关。 ②　硅醇基显较弱的酸性，因而，硅胶只能用于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它分离。 ③　硅胶的活化温度通常为105℃－110℃，不能过高。 2. 氨基酸与茚三酮的显色反应 茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛，与此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生成紫红化合物而使氨基酸斑点显色。 3. 混合氨基酸被分离后在薄层层析图谱上的位置用相对迁移率—Rf值（rate of flow）来表示。 层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf值。 即： Rf=原点到层析斑点中心的距离 原点到斑点对应前沿的距离 由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。 三、材料与方法： 1.实验材料 （1）材料：分析样品 （氨基酸混合液）、吸附剂（硅胶）、粘合剂（0.5%的羧甲基纤维素钠）、氨基酸的异丙醇溶液（丙氨酸、精氨酸、甘氨酸）、展开-显色剂（正丁醇、乙酸、水、茚三酮溶液）； （2）器材 ：层析板、尺子、铅笔、烧杯、玻棒、量筒、吹风机、毛细管、层析缸、药匙、烘箱。 2.实验步骤 （1）实验流程： 制板 点样 层析 显色 数据处理与结果分析 （2）操作步骤： ①薄层板的制备： 调浆：称取硅胶3克，加0.5%的羧甲基纤维素钠8毫升，调成均匀的糊状。 涂布：取洁净的干燥玻璃板均匀涂层。 干燥：将玻璃板水平放置，室温下自然凉干。 活化：70℃烘干30分钟。切断电源，待玻璃板面温度下降至不烫手时取出。 ②点样： 标记：用铅笔距底边2cm水平线上均匀确定4个点并做好标记。每个样品间相距约1cm。 取样：用毛细管分别吸取氨基酸溶液，取样量为毛细管柱高5cm。 点样：点样毛细管轻轻接触薄层表面点样（轻触疾起）。加样后原点扩散直径不超过2mm。 ③层析： 将薄层板点样端浸入展层-显色剂，展层-显色剂液面应低于点样线。盖好层析缸盖，上行展层。 当展层剂前沿离薄层板顶端2cm时，停止展层，取出薄板，用铅笔描出溶剂前沿界限。 ④显色： 用热风吹干或在90℃下烘干30分钟，即可显出各层斑点。 四、结果与讨论： 1.结果： 数据处理： 样品斑点-原点溶剂前缘-原点Rf值Ala3.205.900.542Gly2.605.900.441Arg1.505.900.254混合点11.505.900.254混合点22.605.900.441混合点33.105.900.525（注：单位为cm） （2）实验现象： ①点样后的斑点直径大小适中，不超过0.2cm。 ② 层析时，浸入展层-显色剂中的薄层板放得比较正，且展层-显色剂液面低于点样线，在层析约40min后溶剂前缘达层析板的1/2处，取出并用铅笔描出溶剂前沿界线，溶剂前沿