His-tag蛋白质纯化.docVIP

Ni柱纯化His-tag蛋白质 一 非变性条件下抽提His-Tag蛋白质 下列方法适用于从细菌中抽提通常含有连续6个组氨酸尾（His Tag Protein） 的具有天然结构的可溶性重组蛋白质（Native Protein）。其他来源的蛋白质样品，如果目标蛋白质具有His-Tag结构，提供的层析方法可供参考。 1.样品准备 1) 准备细胞，接种，诱导表达。对于实验室用的pET载体表达系列，在细胞OD600=0.5-0.8时，用1mM IPTG诱导1-3小时，可以获得理想的表达效率。收集细胞，置于-70度或立即进行步骤2操作。 2) 加入1/20细胞生长体积的NTA-0 Buffer（20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10% Glycerol）和PMSF。PMSF用无水乙醇配制成200mM储存液，-20度或4度保存；PMSF使用的工作浓度位1mM；注意：PMSF见水分解，需要在使用前加入。该步骤冰上操作。 3)将细胞悬浮起来，加入溶菌酶（工作浓度位0.2-0.4mg/ml，如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE，可以不加溶菌酶），混匀，冰上放置30分钟，超声或匀浆破碎细胞。该步骤冰上操作。 4)加入10% Triton X-100, 使Triton的终浓度为0.05%，充分混匀，冰上放置15分钟，间或混匀）；冰上超声破碎细胞，同时降低粘稠度。