尼美舒利对人小细胞肺癌细胞株NCLH446增殖的抑制作用.docVIP

尼美舒利对人小细胞肺癌细胞株NCLH446增殖的抑制作用 作者：刘英杰 ，马远方， 刘广超， 吴雄文 【摘要】 目的 研究 尼美舒利对人小细胞肺癌细胞株NCLH446增殖的抑制作用,为临床 治疗 提供实验室依据。 方法 常规培养人小细胞肺癌细胞株NCLH446，MTT法检测尼美舒利的细胞毒性作用；倒置显微镜与Hoechst 33258荧光染色观察细胞形态学变化；流式细胞术(FCM) 分析 细胞凋亡率。结果 MTT显示尼美舒利呈剂量与时间依赖性抑制人小细胞肺癌细胞株NCLH446的增殖；倒置显微镜下可见细胞变小、变圆、皱缩、部分细胞脱落飘浮于培养基中。荧光显微镜下可见细胞核染色质致密浓缩、荧光强度增强、染色质边集、核破碎，凋亡小体形成等。FCM检测结果表明尼美舒利既可诱导NCLH446细胞凋亡，又可引起坏死，400μmol/L的尼美舒利作用细胞24h后，细胞早期凋亡率为7.65%，晚期凋亡率为29.76%，细胞坏死占23.9%。结论 尼美舒利对体外培养的人小细胞肺癌细胞株NCLH446有较显著的抑制作用,该作用与诱导细胞凋亡与坏死有关。 【关键词】 人小细胞肺癌细胞株NCLH446； 尼美舒利； 细胞凋亡 Inhibitory Effects of Nimesulide on Proliferation of Human Small Cell Lung Cancer Cell Line NCLH446 Key words：Human small cell lung cancer; Cell line NCLH446； Nimesulide； Apoptosis 近年来,选择性环氧化酶2 抑制剂的抗肿瘤作用日益引起重视，尼美舒利（Nimesulide）是一种人工合成的环氧化酶2特异性抑制剂, 其对人小细胞肺癌细胞株NCLH446有无抑制作用国内外 文献 未见报道，本研究旨在通过MTT、倒置显微镜与荧光显微镜,流式细胞仪等实验方法观察尼美舒利体外对人NCLH446细胞株的抑制作用,为临床小细胞肺癌的治疗提供实验室依据。 1 材料与方法 1.1 材料 人小细胞肺癌细胞株NCLH446购自 中国 科学 院细胞库，尼美舒利购自Cayman公司；RPMI 1640培养基、胎牛血清为TBD公司产品；MTT为sigma公司产品。FITCAnnexin V/PI 细胞凋亡检测试剂盒为BD公司产品。 1.2 方法 1.2.1 MTT法细胞毒性分析 将对数生长期NCLH446细胞制备成5×104/ml的细胞悬液,接种于96孔培养板中,每孔200μl, 于37,5% CO2的培养箱中培养，24h后换为含有不同浓度尼美舒利(0.78125、1.5625、3.125、6.25、12.5、 25、 50、 100、 200、 400、800μmol/ L)的培养液，对照组以正常培养液替代尼美舒利,每孔200μl，分别培养24、36、48、60、72h, 更换不含药物的培养液200μl/孔，并加入0.5% MTT 20μl/孔，继续培养4h，弃上清，每孔加入150μl DMSO,振荡10min，全自动酶标仪( The rmo Multiskan Ascent)测OD570吸收值。每一浓度设4个复孔，实验重复3次。细胞抑制率=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。 1.2.2 细胞凋亡形态学观察 在6孔板中放入盖玻片，加入含NCLH446细胞的164010培养液，细胞密度为3×105/ml，2ml/孔，置37，5% CO2培养24h，弃去培养液，加入含400μmol/L尼美舒利的164010培养液2ml/孔，对照孔仍用正常培养液。置37、5% CO2培养24h。倒置显微镜下观察细胞形态变化，将盖玻片取出，用PBS洗后，丙酮固定5min，再用PBS洗，Hoechst 33258染色10min，水洗，甘油封片，在荧光显微镜下观察细胞核形态变化并拍照。 1.2.3 流式细胞仪检测NCLH446细胞凋亡率 收集并制备NCLH446细胞悬液，加入24孔培养板，1ml/孔，细胞密度为105/孔，置37，5% CO2培养24h，把培养液换为含400μmol/ L尼美舒利的164010，空白孔及对照孔仍用正常培养液，置37，5% CO2温箱培养24h，收集细胞于小离心管中离心，用标记液洗一次，每孔细胞悬浮于100μl标记液中，加FITCAnnexin Ⅴ溶液及PI染液各5μl，混匀后避光室温放置15min，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，Cellquest软件分析。 2 结果 2.1 MTT法尼美舒利对NCLH446细胞的毒性作用 MTT结果显示尼美舒利对NCLH446细胞的体外增殖有较强的抑制作用，且存在时间和剂量依赖性。当尼美舒利