放线菌SPRI70014杀草成分的研究.docVIP

放线菌SPRI70014杀草成分的研究 作者：顾学斌 徐文平 叶高艺 张育雷 倪玮玮 陶黎明 【摘要】 一株来源于江西土壤代号为SPRI70014的放线菌发酵产物具有很强的杀草活性，本文采用溶剂萃取、硅胶柱层析及制备HPLC等手段对该菌株发酵产物的活性组分进行了活性跟踪分离，得到纯度大于98%化合物纯品，通过理化性质及波谱学分析，鉴定其结构为2［2(3，5二甲基2氧环己基)6氧四氢吡喃4基］乙酰胺。并用除草剂生测标准化操作法(SOP)初步评价了该化合物除草活性。 【关键词】 放线菌； 次级代谢物； 乙酰胺； 杀草活性 ABSTRACT To explore the herbicidal active component in fermentation of a soil actinomycete SPRI70014, a compound was isolated and purified by using solvent extraction, silica gel column chromatography and preparative HPLC. The separation procedure was traced by herbicidal activity. By means of physicochemical properties and spectral analyses, the structure of the compound was determined as: 2［2(3,5Dimethyl2oxocyclohexyl)6oxotetrahydropyran4yl］acetamide. The herbicidal activity of the compound was assayed by SOP method. KEY WORDS Actinomycete; Secondary metabolites; Acetamide; Herbicidal activity 利用微生物和生物源产生的活性物质作为新农药的研究开发正受到世界各国研究人员极大的重视［1］。这是因为天然物质一般来说易被 自然 界分解而不污染环境，而且还可以利用微生物生长繁殖所需的几乎相同的设备条件和再生资源来生产不同的产品，能耗低、投资省。 上海市农药研究所在微生物源农药的筛选中发现70014菌株所产生的代谢物质对杂草的生长有显著的抑制作用。为阐明它的杀草活性成分，采用了除草活性跟踪的方法，对其发酵物进行研究，分离纯化得到了1个化合物，利用理化性质和MNR等波谱分析，鉴定出活性组分的结构。本文着重报道SPRI70014的放线菌所产活性组分的分离提取、结构鉴定及活性研究。 1 材料与方法 1.1 试验试剂和仪器 WRS1A数字熔点仪(温度计未校正)；Varian INVOA400核磁共振仪；QTOF ULTIMA GLOBAL GAA076 LC型质谱仪；LCAT高效液相色谱仪；Sephadex LH20和层析用硅胶(G)分别为Pharmacia公司和青岛海洋化工厂产品。活性测试采用国家创制中心室内盆栽试验SOP所制定的生测方法［2］。 1.2 菌株的分离与培养 (1)产生菌株 放线菌SPRI70014从江西新赣地区的土壤中分离得到。 (2)培养 从28培养4d高氏1号培养基上取适量菌体，接种于种子培养基(葡萄糖4.0%，黄豆饼粉3.0%，酵母粉0.5%，硫酸胺0.1%，氯化钠0.1%，磷酸氢二钠0.005%，自来水配制，pH值调至7.2)，于28，220r/min的条件下摇床培养2d得到种子培养液。将该种子培养液按10%的接种量接种于400瓶每瓶含50ml液体培养基(成分同上)的250ml三角瓶中，28，220r/min摇床培养4d，得发酵液20L。 1.3 活性测试 (1)生物活性测试 用上海市农药研究所制定的生测方法［2］进行活性跟踪。 (2)活性组分的确定 发酵液经过离心分离后，菌丝体用80%丙酮浸泡。酮浸泡液减压浓缩蒸干，得到浸膏，少量甲醇溶解并加水恢复到发酵液原体积；与离心得到的上清液一起，分别稀释20倍，进行活性测定。上清液显示了很强的杀草活性。结果表明活性组分主要集中在上清液中。取30ml上清液，分成三份，分别加入等体积的乙酸乙酯和正丁醇萃取并测试活性。结果表明，只有正丁醇具有与上清液相应的生物活性，故确定活性部位。 1.4 提取分离 发酵液高速离心，分为上清液和菌丝体两部分。菌丝体用80%的丙酮液浸泡过夜，滤液经减压蒸馏除去丙酮后，合并上清液共16L，用稀盐酸调节溶液pH值约为5～6，有沉淀析出，静置过夜，过滤得上清液。减压蒸馏浓缩