桂枝汤对脾虚大鼠NFAT mRNA，IL4 mRNA，IFNγ mRNA的干预作用_0.docVIP

桂枝汤对脾虚大鼠NFAT mRNA，IL4 mRNA，IFNγ mRNA的干预作用 【摘要】 目的：采用RTPCR 方法 来探讨桂枝汤对脾虚NFAT mRNA，IL4 mRNA，IFNγ mRNA的 影响 以及干预Th1/Th2细胞漂移的机制. 方法：40只大鼠随机分为空白对照组(A组)、脾虚组(B组)、桂枝汤大剂量组(C组)和桂枝汤小剂量组(D组)等4组，每组10只；用规范的脾气虚证大鼠模型造模方法将B，C和D组大鼠造模，B，C和D组分别用蒸馏水、 桂枝汤大剂量、 桂枝汤小剂量灌胃，标本采集后用RTPCR检测NFAT mRNA， IL4 mRNA和IFNγ mRNA表达水平. 结果：脾虚组的NFAT mRNA，IL4 mRNA表达上调；而IFNγ mRNA表达下调，经桂枝汤大、小剂量组 治疗 后，NFAT mRNA，IL4 mRNA表达下调，IFNγ mRNA表达上调. 结论：桂枝汤对Th1/Th2细胞漂移作用途径可能是通过下调NFAT mRNA的表达，恢复了IFNγ mRNA正常转录水平，进而下调IL4 mRNA的表达，使脾虚大鼠Th1/Th2细胞达到一种新的平衡. 【关键词】 桂枝汤；活化T细胞核因子；白细胞介素4；γ干扰素 0引言 现代 医学表明，在生理条件下，Th1细胞和Th2细胞分泌的两类因子互相调整，相互制约，处于一种动态平衡状态. 一旦两者平衡失调，细胞因子作用于细胞表面相应受体，活化信号转导因子(signal transducer factor, STF)，将刺激信号传至核内而发挥其基因转录的调节作用，使机体局部乃至全身发生病理反应［1］. 我们通过观察脾虚证模型动物Th1细胞、Th2细胞中具有代表性的γ干扰素(interferonγ，IFNγ)、白介素4(interleuin4，IL4)以及T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells, NFAT) mRNA的表达以及桂枝汤对三者的影响， 探讨脾虚证模型动物与Th1/Th2细胞漂移的关系以及桂枝汤对其的逆转作用. 1材料和方法 1.1材料SD大鼠40只， 清洁级， 雄性，体质量200~300 g，由上海实验动物中心提供. 在江西中医学院动物实验中心清结级25~27条件下饲养. SD大鼠在动物房适应性饲养1 wk后，称质量并随机分为空白对照组（A组），脾虚模型组（B组），桂枝汤大剂量组（C组），桂枝汤小剂量组（D组），每组10只. 桂枝汤中桂枝、白芍、甘草、生姜、大枣购于江西中医学院附属 医院 ，按《伤寒论》原方1010∶7∶10∶10（W/W）配比混合药物(大枣剖开)置于烧杯中. 加入5倍蒸馏水冷浸60 min，快速加热至沸腾，而后保持微沸状态15 min，趁热抽滤，药渣中加入3倍蒸馏水，浸泡30 min，快速加热至沸，微沸10 min，趁热抽滤，弃药渣，合并滤液，水浴浓缩相当于生药1 kg/L的滤液，4保存. 主要试剂与仪器有卵清蛋白、刀豆蛋白A（均为Sigma公司），Trizol (GibcoBRL公司)，Rmasin, MMLV（Promega公司），Tag酶（上海生工），并由上海生工合成引物，DNAmark(北京鼎国生物试剂公司)，PCR仪（PE480美国PERKIN ELMER公司），紫外分光光度仪（DU530美国BECKMAN公司），Eagle Eye II成像 分析 系统(美国). 1.2方法 1.2.1模型建立先按初步规范的脾气虚证大鼠模型造模方法建模［2］. 造模30 d后大鼠表现符合中医学中的脾虚症状. 1.2.2给药除A组10只大鼠不需造模外， B，C和D组共30只大鼠按 文献 ［2］方法造模30 d. A组大鼠胃饲蒸馏水2.5 mL， 2次/d，连续14 d；成模后B组大鼠灌服蒸馏水2.5 mL， 2次/d，连续14 d；成模后C组大鼠灌服桂枝汤滤液，约为6 g/kg［3］， 2次/d，连续喂药液14 d；成模后D组大鼠灌服桂枝汤滤液，约为3 g/kg，2次/d，连续喂药液14 d (C，D两组给药剂量按人与动物间体表面积折算). 1.2.3细胞悬浊液的制备采用常规方法, 大鼠拉颈处死, 无菌条件下剪开腹腔取出脾脏研磨,在100目铜网上轻轻挤压，培养基上培育并制成细胞悬液,用低渗压除去红细胞,以Hanks液洗涤, 配成1×1010/L及2×1010/L脾细胞悬液. 滤过后将收集的脾细胞悬液加到淋巴细胞分离液中，吸出中间灰白色细胞层，用尼龙毛柱T细胞分离法分离T淋巴细胞［4］. 1.2.4增殖刺激重悬T淋巴细胞， 调整浓度为1×109/L，用台盼蓝染色，活性细胞＞95%，置于24孔培养板中，每孔加细胞悬液1 mL，各组内加入卵清蛋白至终浓度0.2 g/L，刀豆蛋白A 25