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动物微生物学及免疫学 （实践教学）结题报告 疑似仔猪白痢与仔猪副伤寒病死猪病料中病原菌分离鉴定 班 级：指导教师： 时 间：蒋 2015年6月 疑似仔猪白痢与仔猪副伤寒病死猪病料中病原菌分离鉴定 指导老师： 摘要：肠杆菌科的细菌种类众多，在自然界广泛分布，本实验从疑似仔猪白痢与仔猪副伤害病死猪病料中培养分离病原菌，对该细菌进行分离培养、生化鉴定、药物敏感实验和动物实验，整个实验以微生物学的知识作为理论支撑，在实验过程中运用细菌分离鉴定的基本方法，达到实验目的。 关键字：仔猪白痢 仔猪副伤寒 大肠杆菌 沙门氏菌 分离鉴定 1 实验依据： 仔猪白痢也称迟发性大肠杆菌病，是一种肠道传染病，多发于10～30日龄。临诊上以下痢、排出灰白色粥状粪便为特征。 仔猪副伤寒也称猪沙门菌病，是由沙门菌引起的仔猪的一种传染病，常发生于6月龄以下仔猪，特别是2～4月龄仔猪，多见急性者为败血症，慢性者为坏死性肠炎。 大肠杆菌（E.coli）和沙门氏菌(Salmonella)同属肠杆菌科，分别为埃希氏菌属和沙门氏菌属的代表菌。 大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢的直杆菌，兼性厌氧，两端钝圆，散在或成对，大多数以周生鞭毛运动。碱性染料对本菌有良好的着色性，菌体两端偶尔略深染。在琼脂培养基形成圆形凸起、光滑、润湿、半透明、灰白色菌落;麦康凯琼脂上形成红色菌落；本菌能够发酵多重碳酸化合物产酸产气。大多数菌能够迅速发酵乳糖。 沙门氏菌为革兰氏阴性的直杆菌，兼性厌氧。通常都以周生鞭毛运动。绝大多数发酵葡萄糖产酸产气。在三糖铁（TSI）上产生硫化氢。在肠道杆菌选择或鉴别培养基上，大多数菌因为不发酵乳糖而呈无色菌落。麦康凯琼脂上典型菌落呈透明、无色，有时带有暗色中心。 2 试验内容 平板和斜管培养基的制备； 病原菌增菌培养； 病原菌分离培养； 病原菌培养特性鉴定； 病原菌生化鉴定； 病原菌药物敏感实验。 3 试剂与器材 材料：麦康凯琼脂粉，琼脂粉，三糖铁琼脂，亚硫酸铋(BS)琼脂，伊红美蓝琼脂，氯化镁孔雀绿增菌液，牛肉膏，蛋白胨，氯化钠，磷酸氢二钾，结晶紫，石炭酸复红，95％乙醇，革兰氏碘液，生化管（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖蛋白胨水、蛋白胨水、硝酸盐还原、硫化氢），乙醚，药敏纸片（四环素、环丙沙星、卡那霉素、青霉素、呋喃唑酮）； 器材：接种环，试管，培养皿，三角瓶，电炉，天平，移液枪，PH试纸，酒精灯，玻片，显微镜，恒温培养箱，高压灭菌锅，量尺。 4 方法和步骤 4.1 平板和斜管培养基的制备 根据需要制备普通琼脂培养基、普通肉汤、增菌培养基、麦康凯培养基、BS培养基、伊红美蓝培养基和三糖铁斜管培养基。 将配好的培养基装入三角瓶或试管进行高压蒸汽锅内，121℃灭菌30min。待三角瓶冷却至60℃在无菌室倒平板，每个平板约15ml。 4.2 病原菌的增菌与分离培养 无菌取病死猪心、肝病料，分别进行组织触片，自然晾干固定，美兰染色5min，冲洗后吸干镜检。 将心、肝病料剪成小块，分别接种于普通肉汤、增菌培养基各1支，在37 ℃水浴摇床中培养24 h。 4.3 病原菌培养特性鉴定 4.3.1 菌落特征观察 用接种环接种增菌培养基中的菌液于普通琼脂平板、BS平板、伊红美蓝平板和麦康凯平板，各2个，37 ℃培养24 h，观察病原菌在4种培养基上的菌落特征，并记录。发现有特征不同的多种菌落，分别取单个菌落进行镜检观察，取显微镜下符合大肠杆菌或沙门氏菌形态特征的菌落，继续纯化分离鉴定，直至得到较纯的菌。 4.3.2 病原菌形态染色特性鉴定 分别对4种培养基的单个疑似菌落进行镜检。 在洁净玻片上轻滴1滴蒸馏水，无菌勾取菌落于水中，火焰固定，结晶紫染色1-2min，洗涤，革兰氏碘液染色1-3min，洗涤，95%酒精脱色30-60s，洗涤，稀释的石炭酸复红染色10-30 s，洗涤，吸干多余水分，滴加香柏油，在10×100倍的显微镜镜检，观察并绘图。 4.4 TSI实验 取上述鉴定中符合大肠杆菌或沙门氏菌形态特征的菌落，以接种针挑取菌落涂布并穿刺接种于斜面，置36±1℃培养18-24h观察结果。 4.5 病原菌生化鉴定 分别取大肠杆菌和沙门氏菌的合格菌进行生化实验。 取生化管，在1/3-1/4处掰开，在酒精灯火焰旁，用接种针将菌落接种到11种（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖蛋白胨水、蛋白胨水、硝酸盐还原、枸缘酸盐、硫化氢）培养管生化管中，每种生化发酵管各1支，上下抽动3次接种针完成接种。每次接种前后都要对接种针进行灭菌，每次接种好一种培养管，将培养管倒插在泡沫板上。37℃培养48 h，观察并记录结果。 4.6 药敏试验 4.6.1 操作方法 将两种菌分别用灭菌接种环致密划