2核酸的分离纯化.pptxVIP

第二章 核酸的分离纯化;DNA和RNA是生物体中最重要的核酸分子，是分子生物学和分子诊断的研究对象 DNA和RNA的分离纯化是分子生物学研究及分子诊断最基础的工作;核酸分离纯化的原则: 保持核酸一级结构的完整性 尽可能提高核酸制品的纯度;核酸分子提取的技术路线;第一节 核酸分离纯化的设计及原则;第一节 核酸分离纯化的设计及原则;一、材料与方法的选择;（一） 材料与方法的选择; 1.保持核酸碱基序列的完整性 2.尽量清除其它分子的污染，保证核酸纯度 3.保持核酸的完整性 尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间 尽量避免各种有害因素对核酸的破坏 ;二、技术路线的设计;（一）核酸的释放; 应该清除的杂质主要包括: 1.非核酸的大分子污染物 蛋白质、多糖及脂类物质等 2.非需要的核酸分子 分离某一核酸分子时，其它核酸皆为杂质 3.加入的有机溶剂和某些金属离子;（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤;三、核酸的鉴定与保存;（一）核酸的鉴定; 紫外分光光度法： 核酸分子中的碱基具有共轭双键结构，可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm。 ; 各种碱基的紫外吸收光谱; 荧光光度法： 核酸的荧光染料溴化乙锭嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在 UV 激发下发出红色荧光。荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。;EB与DNA的结合 ; 紫外分光光度法： 主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的污染。比值升高或降低均提示制备的核酸纯度不佳。;1.DNA或RNA的定量 OD260=1.0相当于 50μg/ml双链DNA 40μg/ml单链DNA（或RNA） 20μg/ml寡核苷酸 2.判断核酸样品的纯度 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0; 荧光光度法： EB等荧光染料示踪的核酸电泳可判定核 酸制品的纯度。;琼脂糖凝胶电泳： 以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳可判定核酸制品的完整性 基因组DNA如果发生降解，电泳图呈拖尾状;DNA的降解; 完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条 带荧光强度应呈特定的比值。 沉降系数大，电泳迁移率低，荧光强度高 沉降系数小，电泳迁移率高，荧光强度低 ; 28S（或23S）RNA的荧光强度一般约为18S（或16S）RNA的2倍，否则提示有RNA的降解 若在点样孔附近有着色条带，提示可能存在DNA的污染 ;（二）核酸的保存;; 2.RNA的保存;第二节 真核基因组DNA的分离纯化;生物体组织细胞;基因组DNA的提取 --- 酚抽提法;血基因组DNA试剂盒;一、酚抽提法; 一、酚抽提法;二、甲酰胺解聚法; 三、玻棒缠绕法;四、其它方法;五、 DNA片段的纯化;六、 DNA片段的回收;（二） 从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段;1.二乙基氨基乙基-纤维素膜插片电泳法 2.电泳洗脱法 3.冷冻挤压法 4.低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法;（二）从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段;第三节 质粒DNA的提取与纯化 ;质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状DNA分子其大小范围从lkb至200kb以上不等已经在形形色色的细菌类群中发现质粒这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。 质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术。 ;;质粒特性;质粒DNA的提取和纯化 ;2．细菌的收集; 碱裂解法 煮沸法 SDS裂解法 Triton-溶菌酶法 ;二、煮沸裂解法;一、碱裂解法;细胞裂解后，细胞壁、细胞膜的碎片、变性的蛋白质和染色体DNA形成大的复合物 当pH调至中性，质粒DNA重新恢复天然的超螺旋结构 在高盐条件下沉淀，经离心分离，质粒DNA保留在上清液中;二、煮沸裂解法;质粒DNA因结构紧密不会解链，当温度下降后，可重新恢复其天然超螺旋结构 通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA, 然后回收上清液中的质粒DNA;三、SDS裂解法; 由于条件温和， SDS裂解法特别适用于大质粒DNA（15kb）的提取。但由于部分质粒DNA会与细胞碎片缠绕在一起而丢失，故产率不高。;四、其他方法;直接将酚/氯仿与细菌培养物混合，然后离心去除大部分蛋白质和染色体DNA，最后从上清液中回收质粒DNA 简单快捷、成本低，提取的质粒可用