杂交瘤技术制备单克隆抗体资料.ppt

预防措施 1.大量保持和补充液氮冻存的细胞原管； 2.倒置显微镜经常检查细胞生长状况； 3.不让细胞“过度生长” 4.不让培养物不加检查任其连续培养几周或几月； 抗体的纯化： 硫酸铵沉淀 凝胶过滤法 离子交换层析 亲和层析 硫酸铵沉淀 大量的盐加入到蛋白溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，可夺取蛋白质的水化层，使蛋白质胶粒失水发生凝聚而沉淀析出 血清 50%饱和度硫酸胺 上清 （清蛋白） 沉淀（球蛋白） 33%饱和度硫酸胺 上清 沉淀 拟球蛋白 r球蛋白 凝胶过滤法 干燥的凝胶颗粒吸水后形成了多孔胶粒，将蛋白质溶液加在凝胶柱上进行洗脱时，大分子蛋白不能穿过凝胶网孔进入胶粒内，留在胶粒间隙的溶液中，随洗脱液最先流出，小分子蛋白可穿过凝胶网孔进入胶粒内，受到凝胶的阻留，向下移动较慢洗脱出来较慢，据此将不同大小的蛋白质分离出来。 交联葡聚糖凝胶(Sephadex) 琼脂糖凝胶(Sepharose) 离子交换层析法 DEAE纤维素：结合溶液中带负电荷的蛋白质，又称阴离子交换剂 CM纤维素：结合溶液中带正电荷的蛋白质，又称阳离子交换剂 亲和层析法 将抗原（或抗体）连接到固相载体上，特异性吸附液相中的抗体（或抗原），形成抗原抗体复合物，然后改变条件，使抗原抗体复合物解离洗脱出纯化的抗体（或抗原）。 A蛋白-Sepharose CL 4B 三、单克隆抗体的应用 检验医学诊断试剂 （1）病原微生物抗原抗体的检测 （2）肿瘤抗原的检测 （3）免疫细胞及其亚群的检测 （4）激素测定 （5）细胞因子的测定 蛋白质的提纯 肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术 * * * 抗体部员工培训之—— 单克隆抗体（McAb）： 是由只识别单一抗原决定簇的B细胞克隆产生的同源抗体。 理化性状高度均一 效价高 只与一种抗原表位发生反应、生物活性单一 具有高度特异性又易于大量制备 如何获得McAb? 如何大量获得McAb? 需要克服哪些技术问题？ 理想的抗体分泌细胞： 具有合成和分泌抗体的能力 具有大量无限生长的特性 在1975年，Kohler 和Milstein将来源于小鼠骨髓的骨髓瘤细胞和啮齿动物可以分泌抗体的细胞融合后形成杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞具有肿瘤细胞无限繁殖的能力，也具有免疫细胞分泌抗体的能力，后来将这种杂交细胞系统统称为杂交瘤（hybridoma）。 通过筛选，分离得到针对特异性抗原并具有所要求的抗体亲和力的杂交瘤细胞。在适当营养条件下，杂交瘤细胞能够生长和无限制性传代，并且能产生大量单一类型的抗体及单克隆抗体。 一、杂交瘤技术的基本原理 二、单克隆抗体的制备 三、单克隆抗体的应用 一 杂交瘤技术的基本原理 利用聚乙二醇作为细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细?胞与具有在体外不断繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一?体，在HAT选择性培养基的作用下，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经过反复的免疫学检测筛选和单个细胞培养（克隆化）,最终获得既能产生所需单克隆抗体,又能不断繁殖的杂交瘤?细胞系，将这种细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，在其产生的腹水中即可得到高效价的单克隆抗体。 流 程 杂交瘤技术 1.颗粒性抗原 免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果 2.可溶性抗原 免疫原性弱，一般要加佐剂， 可溶性抗原10-50ug/100ul+等量弗氏完全佐剂注射小鼠腹腔， 2-4周后加强免疫（量减半，改用不完全佐剂，可反复多次） 冲击免疫（融合前3天进行） 选用6-12周龄Balb/c小鼠　 免疫方案 不产生Ig的重链和轻链 HGPRT- 与提供淋巴细胞的动物品系相同 小鼠骨髓瘤细胞 处于免疫状态脾脏中的B淋巴母细胞或浆母细胞 动 物： 6～12周龄 20g～25g体重 免疫脾细胞 细胞融合剂： PEG:分子量4000 的PEG是最常用的细胞融合剂 作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合 作用特点：不同的分子质量、浓度、作用时间、pH,可能直接影响融合效果 细胞融合 培养骨髓瘤细胞： 对数生长期 浑圆、透亮、均一、排列整齐 避免细胞返祖：定期用8-AG处理细胞 1-2×107 免疫脾细胞的制备： 1-2×10