实验二高效液相色谱法测定未知溶液中绿原酸的含量.doc

实验二 高效液相色谱法测定金银花中绿原酸的含量 【目的】 1、学习高效液相色谱仪的结构及操作方法； 2、掌握高效液相色谱法进行定性和定量的分析方法； 3、掌握索氏提取法对目标物提取的方法。 【概述】 高效液相色谱法是以液体作为流动相的重要的一种色谱分析法。它选用颗粒很细的高效固定相，采用高压泵输送流动相，分离、定性及定量全部分析过程都通过仪器来完成。除了有快速、高效的特点外，它能分离沸点高、分子量大、热稳定性差的试样。 根据使用的固定相及分离原理不同，—般将高效液相色谱法分为分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱和空间排斥色谱等。 在分配色谱中，组分在色谱柱上的保留程度取决于它们在固定相和流动相之间的分配系数K: K=组分在固定相中的浓度/组分在流动相中的浓度 显然，K越大，组分在固定相上的停留时间越长，固定相与流动相间的极性差值也越，因此，相应出现了流动相为非极性而固定相为极性物质的正相液相色谱法和以流动相为极性而固定相为非极性物质的反相液相色谱法。目前应用最广的固定相是通过化学反应的方法将固定液键合到硅胶表面上，即所谓的键合固定相。若将正构烷烃等非极性物质(如n—CN烷)键合到硅胶基质上。以极性溶剂(如甲醇和水)为流动相，则可分离非极性或弱极性的化合物。 样品经进样系统注入到色谱仪，在色谱中进行分离分配，按时间顺序流出色谱柱，进入检测器，检测器将各组分的质量信号转变成电信号，得到色谱图，进行定性、定量分析。 【器材与试剂】 1.器材 （1）LC-20A型高效液相色谱仪 （2）紫外检测器 （3）计算机 （4）打印机 （5）20ul微量进样器 （6）抽滤装置 （7）色谱柱：250mm×4.6mm，n-C18柱 （8）容量瓶 （9）移液管 （10）吸耳球 （11）电子天平 （12）量筒（13）滤膜（0.25μm） （14）注射器 （15）过滤头（0.25μm） （16）索氏提取器装置 （17）水浴锅 （18）烧杯 2.试剂 （1）绿原酸标准品。 （2）甲醇（色谱纯） （3）乙腈（色谱纯） （4）磷酸（优级纯） （5）超纯水 （6）金银花 （7）乙醇 【方法与步骤】 1. 将干燥的金银花用粉碎机粉碎，准确称取8.000g，用滤纸包好，置于索氏提取器中，取90%的乙醇溶液90mL，先往索氏提取器中加90%的乙醇至与虹吸管相平，剩余液体加入圆底烧瓶中，对样品浸泡2h，然后在水浴锅上加热回流至无色，控制温度在80℃左右。回流液过滤，定容于100 mL容量瓶中，得待测液，放于冰箱中待用。 2.流动相的配置 用量筒分别量取磷酸、超纯水和乙腈各5mL、1000 mL和112mL分别加入到2000mL的容量瓶中，振荡摇匀，用0.25μm滤膜进行抽滤，置于盛装流动相的试剂瓶中。 3.标准溶液的配制 用电子天平准确称取5mg绿原酸标品，用甲醇定容于25 mL容量瓶中，振荡摇匀，得0.2mg／mL的绿原酸标准溶液。 4.开启高效液相色谱仪 （1）开启计算机，进入Windows操作界面。 （2）开启高压泵。 （3）开启柱温箱。 （4）开启紫外检测器 （5）双击工作站图标（听到嘀嘀两声鸣叫后，说明工作站已经与仪器连接）， 在教师指导下，设定色谱条件：柱温为250C；流动相流速1.0mL／min；紫外检测波长为327nm。设定完参数后开启高压泵，用流动相进行冲洗柱子。 5.进样 待记录仪基线平直稳定后，分别进标准溶液1.0、3.0、5.0、7.0、10.0、15.0μL，分别记录色谱图。获得标准样的色谱图后，进提取样10μL记录色谱图。 【数据处理】 1.实验数据记录 样品 保留时间 峰高 峰宽度 峰面积 标准样 1.0μL 3.0μL 5.0μL 7.0μL 10.0μL 15.0μL 未知样 2.结果计算 （1）根据保留时间确定样品中是否含有绿原酸。 （2）以积分面积为横坐标，进样量为纵坐标绘制标准曲线，求算金银花中绿原酸的含量。 【思考题】 1.高效液相色谱仪是由哪几部分组成的？ 2.简述高效液相色谱仪的工作过程？ 3.标准曲线法的适用范围？ 4.紫外检测器的使用范围？