赵晓妮细胞培养论文.docVIP

动物胚胎干细胞的培养技术 摘要：1885年，W Rou尝试使组织离体培养，被认为是组织细胞培养技术的萌芽；1907年Harrison和1912年Carrel开始把组织培养作为一种方法，用于研究离体动物细胞的培养，标志着细胞培养技术（Cell culture technology）的诞生。此后，随着抗生素、培养基、培养装置以及工艺方法的不断改进，动物细胞培养（Animal cell culture）的研究和应用逐步增多和深入，发展至今已成为在生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法。利用细胞培养开展体外试验，成为了阐释生命现象、发病机理和筛选药物的重要手段；利用细胞培养技术结合细胞融合（Cell fusion）、细胞杂交（Cell hybridization）以及转基因（Trans-gene）技术进行基因重组、组织构建是遗传和组织工程的重要工具；利用细胞培养生产具有医用价值的酶、生长因子、疫苗和单克隆抗体等，已成为医药生物技术产业的重要部分。[1] 干细胞最早出现于19世纪的文献中。1896年，Wilson在一篇论述细胞生物学的文献中首次使用干细胞这一概念，专门用于描述寄生虫（线虫、蠕虫）生殖系的祖细胞。1897年，Boveri等在进行丝虫研究时发现，在经过连续的卵裂之后，只有一个细胞保留了全部的染色体，这一细胞包含有成体生殖细胞的全部成分。但到目前为止，干细胞仍然是一个广义的概念，但现代干细胞的概念与早期干细胞相比，已经赋予了新的内涵，认为干细胞的最基本特征是具有自我更新能力和分化为成熟细胞的潜能。1962年Edwards首先观察到兔胚泡ES细胞的分化现象。之后，科学工作者对ES细胞进行了深入的研究，取得了诸多突破性的进展。2003年，韩国和美国科学家联手，利用体细胞克隆技术获得人类克隆胚胎干细胞，这一技术的成功表明可以用任何人的自体细胞培育ES细胞，从而使ES细胞向临床应用迈进了一大步。2004年，日本科学家在体外将小鼠的ES细胞诱导分化为精子和卵子细胞，结果进一步证实ES细胞具有向生殖细胞分化的潜能。最近还有科学家利用孤雌繁殖法（卵细胞体外激活培养）培养出早期胚胎，预示人类的自然生殖面临新的课题。[3] 关键词：胚胎干细胞；来源；特点；培养；保存；复苏；前沿；进展 1、胚胎干细胞（ES细胞）的生物学特性 [3] 1.1 ES细胞的来源 ES细胞是来源于特定解剖部位的细胞，包括：胚胎瘤干细胞、由着床前胚泡的内细胞团分离建系而来的胚胎干细胞、胚胎生殖细胞（由早期胚胎原始生殖嵴细胞分离建系而来）。 1.2 ES细胞的基本特点[4] 具有经培养不定期地分化并产生特化细胞的能力，具有以下特点：有多向分化潜能和受精卵的某些特性，可以分化为胎儿和成体内各种类型的组织细胞；可在体外培养的条件下建立稳定的细胞系，可长期增殖培养、冻存并保持高度未分化状态和发育潜能性；将ES细胞与8-16阶段的胚胎共培养后，植入假孕母体子宫，可发育成嵌合动物，其遗传特性可进入胚系，遗传给下一代；对组织损伤产生反应，可迁徙、增殖分化并参与修复过程。体外ES细胞具有培养细胞的特征，最大特点是可对它进行遗传改造、核转移和冻存等而不失去潜能性。 1.3 ES细胞的形态学特点 ES细胞的形态结构与早期胚胎细胞具有相似性，细胞相对较小，细胞核明显，核质比较高，染色质比较分散，有一个或多个核仁，胞质内除游离核糖体外，其他细胞器很少；细胞呈多层集落状生长，紧密堆积在一起，无明显的界限，形似鸟巢。人和灵长类动物的ES细胞形成的细胞集落相对扁平、松散，容易被胰蛋白酶消化成单细胞。而小鼠的ES细胞和人的EG细胞形成的集落一般呈紧密的球形，不易被常规的消化方法消化成单个细胞。 1.4 ES细胞的分子生物学标志 碱性磷酸酶、胚胎阶段特异性表面抗原（SSEA）、端粒酶、Oct-4/Oct-3、干细胞因子和生殖细胞核因子等。 2、干细胞实验条件与设备[5] 干细胞制备培养技术是一种无菌操作技术，要求实验室环境和条件必须保证无微生物污染，不受其他有害因素的影响，并且是符合操作全过程质量控制可追溯性的要求，才能成为临床生物治疗应用技术平台。细胞实验室设立必须符合国家《药品生产质量管理规范》和GMP要求，应当遵循科学、安全、规范、有效、经济、符合伦理的原则。细胞实验室还必须配备符合现代工艺要求和技术标准的硬件设备。 干细胞实验硬件设备主要有细胞采集仪，细胞分离仪，生物安全柜和净化工作台，低温细胞离心仪，二氧化碳细胞培养箱，细胞质量和活力分析仪，流式细胞仪，倒置显微镜和普通光学显微镜，深低温生物冰箱和普通冰箱，程序降温仪和液氮罐，管道热合仪及制冰机等。 3、ES细胞的制备（以小鼠为例）[5] 3.1内细胞团的分离与培养 内细胞团的分离方法有两种：显微分离