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第十三章 体外受精与核移植动物 为什么要进行动物人工繁殖？ 1）野外大熊猫到了圈养环境中繁殖率非常低，78%的雌性大熊猫 不孕，圈养大熊猫90%的雄性大熊猫不育。 2）野生中华鲟产卵场分布在金沙江下游和长江上游的约600公里 江段。葛洲坝、三峡大坝阻断了洄游路线，为了补偿对中华鲟造 成的不利影响，我国在宜昌成立了中华鲟研究所,人工繁殖的幼 鲟，投放长江。 3）对于人类，世界范围内不孕夫妇占10％左右，需要建立人工 助孕技术。 所有的这一切，都必须依赖于动物细胞工程，尤其是胚胎工程和核移植技术。 动物细胞工程 胚胎工程：是指对动物早期胚胎或配子进行的工程 技术操作，获得所需要的成体动物的技术。 包括体外受精、胚胎移植、胚胎分割与融合、胚胎/ 精子/卵子冷冻保存、胚胎性别控制、胚胎细胞核移 植、基因导入等。 体外受精动物(试管动物)：将供体的精子和卵子在体外受精、体外培养胚胎发育到一定阶段，通过胚胎移植移入受体完成发育出生的动物。 体外受精：哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。 发挥优良母畜的繁殖潜力 一头优良品种母牛的卵巢内有几万个生殖细胞，但在一个正 常性周期内只有几个卵泡同时发育，而最终只有一个卵泡成熟 并排卵，如果受精也只能生出一只良种牛犊。一只良种母畜一 生只可能繁殖10个左右的后代，大部分时间用于妊娠和哺乳。 如果能让更多的卵泡成熟排卵，而又让品质平凡的同种母畜“借 腹怀胎”，优良母畜可以获得后代的数目至少增加几十倍。 ①精子采集与体外获能、卵子采集与成熟培养； ②体外受精； ③重组胚激活与体外培养； ④胚胎移植； ⑤体内发育、出生。 采集精子并选择有活力的精子 精子的体外获能：是指精子获得穿卵子透明带能力的 过程。采用添加诱导精子获能物质(钙离子、血清蛋 白、肝素等)的特定培养液来完成精子体外获能。 精子的结构 头部：顶体、细胞核 尾部：颈、中段、主段和末端。 顶体内部含有水解酶，能协助精子穿入卵周围的卵膜。 精子质膜外表面存在有多种凝集素受体。 鞭毛为9＋2微管结构 (一)成熟卵细胞的收集 超数排卵：利用促性腺激素处理，使得卵巢中有更多的卵泡发 育，更多的卵被排出，利用手术取出卵母细胞。目的是最大限 度地利用母畜的生殖能力（牛超数排出5-10个卵母细胞） 卵细胞的收集：在腹腔镜下用吸管吸出卵细胞。 卵子的结构 卵细胞内部物种空间分布具有极性，卵内组分沿着卵的主轴分布不均匀，形成动物级和植物级。卵黄积聚在植物级 卵细胞质分布在两个固定的区域，质膜下细胞质称为皮层，皮层是高度粘滞、半硬的凝胶状，内含有皮层颗粒和色素颗粒。大部分卵细胞质——内质是液体状态，内含线粒体和生殖质。 卵细胞排出卵巢后，有卵膜包被 卵子的发生 在哺乳类，所有卵原细胞成熟和卵原细胞转变为卵母细胞是在胎儿分娩前完成。 卵母细胞形成阶段是从胎儿诞生开始一直到性成熟排卵为止。 直到青春期卵母细胞才进行生长，以后每个性周期后有一批新的卵母细胞继续发育，而多数卵母细胞在每个周期发育中未成熟就退化。 (二)卵母细胞的收集、选择与成熟培养 活体卵巢采集；屠宰后家畜的卵巢中采集。 卵母细胞的选择:分A（三层以上卵丘细胞，卵母细胞质均 匀）B （卵丘细胞低于三层，卵母细胞质均匀)、C（裸露卵母 细胞）和D（死亡或退化卵母细胞）四个等级，一般选择A级和B 级卵母细胞。 卵母细胞的体外成熟培 养成熟的标志：生发泡 破裂；染色体凝集；极 体排出；透明带软化； 卵丘细胞扩展。 ①共培养体外受精： ②显微受精技术：透明带下注射法、卵浆内精子注射 法、透明带修饰法。 受精卵是否可以发育至囊胚是受精是否成功的标志。 精子和卵子经过受精作用形成受精卵，受精卵经过卵裂、形成囊胚，囊胚进一步发育进入原肠胚阶段，形成不同胚层，再产生器官原基，进一步产生个体。 体外受精 受精卵需在体外培养发育至桑椹期或囊胚期才能进行移植。移植的较佳时期是发育至8-16细胞期的胚胎。 卵裂：合子发生分裂形成若干小细胞。卵裂细胞不生长而连续分裂。主要是卵裂球的有丝分裂器与表层胞质变化的过程。 桑椹胚：卵裂数次后，出现实心细胞团，形似桑椹得名。 受精卵在进行卵裂的同时，逐渐向子宫腔移动。受精后72小时，桑椹胚进入子宫腔。 胚泡：哺乳动物的胚胎处于16细胞期的桑椹期时，胚胎是球型细胞团，细胞之间形成充满液体的腔隙，然后它们联合形成一个大腔位于胚胎的一端，即为胚泡结构。 囊胚：桑椹胚随着卵裂出现充满液体的囊胚腔，围绕囊胚腔的细胞组成囊胚层。 原肠胚：囊胚继续发育、分化，形成双胚层或三胚层的原肠胚。外层为外胚层、迁到里面的称为内胚层和中胚层。 哺乳动物胚泡着床 内细胞团：在胚泡胚极一端，能够发育成 为胚胎主体的一团细胞。 滋养层