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引物设计 几种引物设计软件的介绍及使用 一、引物设计的原则 1.引物长度(15-30bp) 典型的引物18bp到24bp。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。 2.引物GC含量 选择GC含量为40％到60％,可使Tm值最好接近72℃。 3.引物5‘端 设计5端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。 4.引物对3‘末端 避免引物对3‘末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。 避免3‘末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。 避免引物3’端出现3个以上的连续碱基。如GGG或CCC，会使错误引发机率增加。 引物3′端不能选择A，最好选择T。A的错配几率最高，T最低。 5. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。否则易形成Hairpin 结构，影响引物与模板的复性结合 。若是不可避免，应选择3‘端△G 4.5kcal/mol 的引物。 一般经验性原则：以所有结构的△G 9kcal/mol 为底线 二、引物设计的方法 1. PC设计 利用下载的引物设计软件，自己设计所需引物。 引物设计的软件：prime primer、oligo、DNAstar等 2. 在线引物设计 Primer3 、Primerfinder、codehop 等等。 Prime Primer5.0 的应用 引物选择 选择标准 1.无二级结构（所有按钮都不是红色显示） 2.产物所处位置是否满足要求。 3. 两条primer 的Tm值相差不超过3℃，最好在1℃内。引物的Tm值最好不低于60 ℃，以保证产物的特异性。 4.引物GC含量是不是在40％～60％间。 引物编辑功能 利用primer primer5.0 进行巢式PCR引物的设计 Oligo 6.0的应用 在线引物设计的站点 Primer3 Very popular primer design tool for designing primers for PCR, hybridization. Primerfinder Easy to use, free, online primer design programMethPrimer A free online program for designing primers for methylation specific PCR (MSP) and bisulfite sequencing PCR. Primo Primo online is a friendly PCR primer design tool. It reduces PCR noise by lowering the probability of random primering. Batch mode allows designing for multiple sequences. Users can also calculate the melting temperature using the nearest neighbor model. Primer3.0 的应用 参数选择 Codehop设计简并引物 CODEHOP Results THANKS! * * 参数设置 单击 单击 ① ② ③ ④ 若是没有办法完全满足以上要求，则按照引物设计原则中△G 要求选择引物。 ① ② ③ ④ 按顺序点击 Search Primer 操作后 上游引物 下游引物 点击三角符号可出来相应的引物序列及分析结果 Frq是6.0版本的新功能，为邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。 图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG和Frq ?G值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的?G值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低。 Tm值曲线以选取72℃附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。 Frq曲线指标，选取引物时，宜选用3’端Frq值相对较低的片段。 Oligo 被认为 是 引物设计功能最强大的软件，特别是它的Tm值预测能力。 GeneFisher 简并引物在线设计 http:/