Trizol法提取细菌总RNA.docVIP

实验三 Trizol法提取细菌总RNA 一、实验原理 Trizol主要物质是异硫氰酸胍，它可以破坏细胞使RNA释放出来的同时，保护RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA 可以通过异丙醇沉淀来还原。无论是人、动物、植物还是细菌组织，Trizol法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(1 g)和细胞(107)均有较好的分离效果。Trizol试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一小时内完成。Trizol抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。 主要试剂Trizol 溶液氯仿异丙醇75%乙醇DEPC水 超净工作台 mL离心管）移液枪 紫外分光光度计 石英比色皿泳槽和模具电泳仪凝胶成像系统大肠杆菌 实验步骤 . 采用 Trizol 溶液提取细菌的总 RNA 1. 挑取菌单菌落，培养至稳定期，取菌液 mL 于 mL离心管离心得菌体； 每管加入 1 mL Trizol 溶液，盖紧管盖，激烈振荡15 s，室温静置5 min 4，12000 g，离心 10 min；取上清转入(约 1 mL)新的 m L离心管中； 每管加入 0.2 mL 的氯仿(0.2 体积 Trizol)，盖紧盖，剧烈振荡 15 s；室温静置 3 min；4, 12000 g, 离心 10 min；小心吸取上层水相，转入另一新的 mL 离心管，测量其体积；加氯仿时应充分震荡使其充分乳化。 加入1倍体积的氯仿，盖紧盖，剧烈振荡 15 s；室温静置 3 min；4，12000 g，离心 10 min；小心吸取上层水相，转入另一已编号新的 mL 离心管； 加入 0.5 mL 的异丙醇(0.5 体积 Trizol)，轻轻颠倒混匀；室温，静置 10 min；4，12000 g，离心 10 min，RNA 沉于管底；小心吸去上清加1 mL75%的乙醇(预冷)，并轻柔颠倒，洗涤沉淀；4，7500 g，离心 5 min； 小心弃上清，微离，吸去剩余乙醇，室温干躁 10 min； 各管用 μL DEPC 处理过的双蒸去离子水溶解，55-60温育5 min，分装，-80贮存(可贮存5周)； . RNA 浓度的测定 取 10 μL RNA 样品以双蒸水稀释至 2 mL，转入预先以无水乙醇隔夜浸泡后晾干的石英比色皿中，小心排除气泡，以等体积的双蒸水作为空白对照，在紫外分光光度计中分别测定 260 nm、280 nm的光吸收值，根据公式计算 RNA 的浓度。 RNA 浓度(μg/μL)= OD260 × 稀释倍数(200)× 40(μg/mL)/1000 纯 RNA 样品的 OD260/OD280 比值为 1.8~2.0，若低于该值，表明存在蛋白质污染，可重新用酚∕氯仿抽提。该值为 2.0 时，RNA 纯度为最高。 . RNA 质量检测 将 RNA 进行琼脂糖凝胶电泳检测，目的在于检测 2 S 和 1S 条带的完整性和它们的比值。一般认为，如果 2 S和1 S 条带明亮、边缘清晰，并且 S的亮度在 1 S 条带的两倍以上，则 RNA的质量较好。 (1) 将洗净、干燥的电泳槽和模具，水平放置在工作台上； (2) 准确称取 0.15 g琼脂糖加入 15 mL 1 × TAE 中，摇匀，在微波炉内将琼脂糖溶液以最短时间完全溶解(中火档 2 min)，待冷却至60时，加入 (终浓度为μL/mL)，充分混匀； (3) 插入适当的梳子，将温热的凝胶倒入胶模中，凝胶厚度为 3~5 mm，置于室温下凝固； (4) 待凝胶凝固后，小心移去梳子，将凝胶置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，使液面高出凝胶 1~2 mm； (5) 用微量移液器将样品μL与上样缓冲液μL混合并将混合液小心加入上样孔内，同时加入合适分子量范围的 DNA 分子量标准作为对照； (6) 盖上电泳槽盖，调节电压 100 V，电泳 min 左右； (7) 电泳完毕后将凝胶置于紫外透射检测仪上观察结果，用凝胶成像系统照相保存。 注意事项 1. RNA制备的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。EP管及Tip头都要用0.1%处理(0.1% DEPC浸泡过夜后，高压蒸气灭菌)用于RNA实验的试剂，须使用DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装，使用的无菌水须用0.1%的DEPC处理后再进行高温高压灭菌。超净台内操作提取时操作带一次性手套小心、细致、晃动及每次移液要轻；在操作过程中避免讲话等。这样做的唯一目的就是两个，一是小心RNAse的污染降解RNA；二是动作过度暴力破坏RNA的完整性。 电泳槽和模具. 一般RNA电泳应该是做甲醛变性电泳，但是一般的琼脂糖电泳也可以，需要上样量稍微大些，并且跑电泳的