WesternBlot实验详细步骤技术总结.docxVIP

Western Blot实验技术制胶SDS分离胶配方表检查制胶器是否漏水，吸干玻璃中水分配置分离胶，加入玻璃板中（注意：不能有气泡和杂物），距离玻璃上口1.5mL停止加胶。再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡，凝胶后倒掉水，吸干水到浓缩胶插梳。上样先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。拔梳子时垂直向上拔出，不可左右摇晃梳子。拔完梳子后观察梳子孔，是否有缺口和歪，用针头拨正。上样时从左到右依次上样。若上样组不多时，左右第一孔不加样。要预留Marker的上样孔。电泳转膜PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。（ 转膜缓冲液：需4度预冷，现配现用，不能放太久。）转印滤纸：全胶长8.5cm，宽5.5cm，需剪裁成7层滤纸，压平后约3mm。需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。海绵垫：在转膜液中平衡浸泡备用。PVDF膜：剪裁8.5cm*5.5cm ，需在甲醇中浸润2min（活化膜上正电基团），然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。凝胶：凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3－5分钟。否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形。三明治夹心法：负极（黑）-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极（白）转膜时间：通电恒流，60V，一个槽100mA左右，1h （注意：在操作过程中用玻棒赶走气泡。 装置转膜仪时注意黑对黑（负对负），白对红（正对正）。 装置运行时需冰浴。）封闭 在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。 封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，本实验室常用的有5%BSA，10%脱脂奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测目的相适应（做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fat milk 封闭）。将脱脂奶粉封闭液（1xTBST:脱脂奶粉=20mL：2g一块膜用量。牛血清蛋白、5%BSA效果更好）倒好。将PVDF膜取出放入封闭液中，盖子改好。封膜一般常温1-2小时即可，也可4℃封闭过夜。一抗抗体反应主要采用间接法: 即先加入未标记特异性一抗与膜上抗原结合后，再加入标记的二抗进行杂交检测，标记二抗物质有放射性核素，酶，以及生物素等。将封闭后的杂交膜，在摇床上用TBST洗膜3次×5min，加入经TBST稀释的一抗（用血清封闭液）4℃孵育过夜或室温摇动孵育2-4小时回收一抗稀释液洗膜1、之后，在摇床上用TBST洗膜3次×5min，二抗加入标记的二抗室温1-2小时，二抗不回收注意：一抗稀释液（稀释2000到4000）及孵育条件，孵育时间最好严格按说明书要求来做。例如：CST某些磷酸化抗体要求5%BSA稀释液稀释，4℃平缓震荡过夜。根据不同的目的条件和目标抗体，可剪膜后孵育抗体，即便做单一条带，仍推荐剪膜，在相同体积抗体下，更小的膜可以使抗原和抗体孵育更充分。 回收的一抗可加入叠氮钠抑菌（-20°保存影响不大）。 二抗作用时间不可太长，2小时之后已无抗原抗体结合，导致背景过深。洗膜1、在摇床上用TBST洗膜3×5min 显影打开电源，预冷成像系统，同时开机，打开GE成像软件，等待显示camera ready。暗室红灯下操作，按EP管中加显色剂A、B（4℃保存）按1：1剂量混匀，ECL发光液现配现用。??用滤纸吸干PVDF膜上的TBST洗涤液。平整铺上保鲜膜，将配好的ECL发光液均匀的涂布于PVDF蛋白膜上，盖上另一半保鲜膜，放上合适大小的胶片，保鲜膜平整赶走气泡，关闭成像仪盖子，开始曝光。曝光时间：根据需要，可先曝10-30s，视首曝决定是否再曝，或曝光时间。曝光后可对图像进行调节，通过调试背景亮度及曝光度。 显色后strippingStripping solution: 100 mM 2-mercaptoethanol, 2% (w/v) SDS, 62.5 mM Tris-HCl, pH 6.7?方法：将用过的膜浸入stripping buffer中，置50℃水浴箱中30min，间断振摇。之后用TBST洗4*5min就好。 此时你已经可以按新的转移好的膜来再次使用了。 该方法的优点：省事，省力，省钱。?常见问题聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法（常用）和光聚合法。PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电泳：体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同；带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统：由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性；带电颗粒在电场中泳