小花棘豆中毒对与田羊内脏器官α―甘露糖苷酶影响.docVIP

小花棘豆中毒对和田羊内脏器官α―甘露糖苷酶的影响 　　摘要：探讨小花棘豆（Oxytropis glabraD C）中毒对和田羊内脏器官α-甘露糖苷酶（AMA）的影响，进一步揭示小花棘豆的毒性作用机理。将12只和田羊随机分为3组，即对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组。试验组分别按10g/kg和20g/kg的剂量饲喂小花棘豆，饲喂至出现典型中毒症状。屠宰后每组随机采集试验羊的肝脏、肾脏、脾脏、心脏和肺脏，检测和田羊内脏器官AMA活性及表达的变化。结果表明，和田羊肝脏、肾脏、脾脏、心脏和肺脏中高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ（AMA1）和溶酶体α-甘露糖苷酶（AMA2）均有表达。试验I组和田羊各器官的AMA2的表达均与对照组差异不显著（P0.05），试验Ⅱ组和田羊肝脏和肾脏AMA2的表达显著低于对照（P0.05）；试验lI组和田羊肝脏和肾脏AMA1的表达极显著低于对照（P0.05）。不同剂量小花棘豆均可降低和田羊内脏中AMA活性及其mRNA表达量，肝脏和肾脏是其主要作用的靶区 关键词：小花棘豆（Oxytropis glabra DC）；苦马豆素；α-甘露糖苷酶；内脏器官 中图分类号：S856.9 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）09-2308-05 小花棘豆（Oxytropis glabra DC）是广泛分布于新疆天然草原的有毒植物之一，具有耐旱、耐贫瘠、返青早、生命力强、繁殖系数高等特性。是制约新疆草原畜牧业发展的重要因素。目前仅南疆阿克苏、和田地区天然草场中广泛丛生小花棘豆的面积已超过20%，每年因采食小花棘豆而中毒的家畜占放牧家畜总数的5%-10%，其中50%左右的中毒家畜死亡。中毒家畜表现为机体的广泛性损伤，剖检发现其内脏器官多出现肿胀等炎症，病理组织学表现主要为细胞空泡变性。国内外研究发现，苦马豆素（Swainsonine，SW）是小花棘豆的主要毒性成分，可通过抑制α-甘露糖苷酶（oL-Mannosidase，AMA）活性，导致机体甘露糖代谢发生异常而发挥毒性作用。研究表明，AMA是动物小花棘豆中毒特异性最强的指标，小花棘豆中毒动物的AMA活性受到显著抑制，但对其转录、翻译、加工修饰等的影响尚不清楚。和田羊是新疆南疆地区的主要放牧品种，占该地区绵羊存栏数的70.97%，在畜牧业生产中占有重要地位。近年来，和田羊小花棘豆中毒已成为该地区畜牧业发展面临的严重问题。本试验通过ELISA、免疫组化和荧光实时定量PCR。以新疆南疆地区小花棘豆为试验材料，研究小花棘豆攻毒对和田羊内脏器官AMA活性及分布、表达的影响。为揭示小花棘豆中毒机制提供基础 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 健康和田羊12只，雌雄各半，体重（32±1.4）kg，购自同一牧场。小花棘豆风干样采自阿克苏市温宿县佳木乡，由塔里木大学动物科学学院草业科学学科组鉴定 S-P超敏组化试剂盒（福州迈新生物技术公司）；AMA检测试剂盒（南京建成生物技术公司）：反转录试剂盒、总RNA提取试剂盒、Real-time PCR试剂盒，均购自TAKARA（大连）有限公司 1.2 试验动物分组与处理 试验羊随机分为对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组。每组4只。对照羊自由采食青干草。每只每日补饲精料300g，试验Ⅰ、Ⅱ组饲喂小花棘豆粉，每天分别按10g/kg和20g/kg的剂量与300g精料加水混匀，饲喂3次，即08：00-09：00、14：00M5：00、19：00-20：00，自由采食后饲喂青干草。自由饮水。待出现喜卧、起立困难、以手提耳出现摇头等典型中毒症状后进行屠宰，分别取肝脏、肾脏、脾脏、心脏和肺脏组织，部分进行免疫组化染色分析，部分利用冰生理盐水制备10%组织匀浆液用于检测AMA活性，部分液氮保存用于检测mRNA水平表达的影响。所有解剖工具及冻存管均需用DEPC预处理 1.3 AMA在中毒羊内脏器官组织的分布 和田羊内脏器官组织均使用4%多聚甲醛固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明后进行石蜡包埋。包埋组织进行连续切片，片厚6μm，二甲苯脱蜡，梯度酒精复水，然后按照试剂盒说明操作。其中抗体稀释比为1/100，DAB显色。使用PBS为阴性对照。常规脱水，透明，封片，光镜下观察组织病理学变化。采用hnage-ProPlus6.0软件对免疫组化获得照片进行分析 1.4 AMA活性测定 按照试剂盒说明书，采用间接ELISA法测定和田羊内脏器官组织中AMA活性。具体步骤为：标准品稀释→加样→温育→洗涤→加酶→温育→洗涤→显色→终止→测定 1.5 AMA表达水平的测定 1.5.1 引物设计与合成 根据GenBank中绵羊高 尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ（AMAl）、溶酶体α-甘露糖苷酶（AMA2）和Bβ-actin基