核苷类似物对小鼠肝脏线粒体DNAD―loop区突变影响.docVIP

核苷类似物对小鼠肝脏线粒体DNAD―loop区突变的影响 　　[摘要] 目的 探讨长期使用核苷类似物（NA）是否导致肝脏线粒体DNA（mtDNA）D-loop区损伤。 方法 选取7周龄Balb/C小鼠25只，将其随机分为对照组和4个NA实验组。对照组腹腔内注射双蒸水，各实验组分别给予司他夫定（D4T）50 mg/kg、齐多夫定（AZT）100 mg/kg、拉米夫定（3TC）50 mg/kg和去羟肌苷（DDI）50 mg/kg，分别腹腔内注射，每周5次，共12周。取各组小鼠肝组织，通过激光捕获显微切割获取肝细胞，对mtDNA D-loop区克隆和测序。 结果 DDI组肝组织中mtDNA拷贝数（0.440±0.040）和肝细胞中mtDNA拷贝数（0.464±0.013）均较对照组[（1.000±0.080）、（1.000±0.058）]显著减少，差异均有统计学意义（均P 　　[Key words] D-loop region； Mitochondrial DNA； Hepatic cells； Nucleoside analogue 核苷类似物（NA）用于治疗人类免疫缺陷病毒（HIV）和乙型肝炎病毒（HBV）感染[1]。NA可抑制人细胞DNA聚合酶γ，干扰核DNA修复及线粒体DNA的合成和修复，导致氧化应激和线粒体功能障碍[2]，与临床许多疾病相关，包括肌病、脂肪萎缩、神经系统疾病和乳酸酸中毒[3]。这些可能是降低抗HIV药效和患者依从性的关键因素[4]。长期应用NA的HIV感染者可发生肝脂肪变性，但NA的肝毒性原因尚不明确。笔者前期研究提示，应用NA的小鼠和HIV感染患者存在神经细胞线粒体毒性[5-6]。本研究通过观察肝组织和肝细胞的线粒体DNA（mtDNA）D-loop区序列变化，明确NA是否会诱导小鼠肝细胞mtDNA病变 1 材料与方法 1.1 实验动物 7周龄、体重28～30 g的Balb/C雌性小鼠25只（军事医学科学院），按照首都医科大学动物保护和使用规定进行动物实验 1.2 分组及给药 将小鼠随机分为4个实验组[司他夫定（D4T）组、齐多夫定（AZT）组、拉米夫定（3TC）组、去羟肌苷（DDI）组]和对照组。各实验组小鼠每天分别给予腹腔内注射D4T 50 mg/kg、AZT 100 mg/kg、3TC 50 mg/kg、DDI 50 mg/kg（东北制药集团有限责任公司惠赠），每周5 d，连续12周。对照组腹腔内注射双蒸水 1.3 实验取材 12周结束时，颈椎脱臼处死小鼠，迅速分离小鼠肝组织于液氮中速冻。最佳切片温度复合物包埋肝组织，-20℃将组织切为6 μm薄片，置于聚乙烯包被的玻片上。行HE染色。晾干5 min，2 h内由有经验的病理医师应用P.A.L.MRobot-Microbeam系统（Oberkochen，德国）对切片行激光捕获显微切割（LCM）获取肝细胞[7] 1.4 DNA提取和实时定量PCR 据DNA提取试剂盒（QIAGEN中国有限公司）说明书提取肝组织和肝细胞DNA。TaqMan 7900HT系统行定量PCR。细胞色素氧化酶亚基Ⅱ（COXⅡ）作为mtDNA的靶基因，核基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参。CoxⅡ正向引物：5’-CGACCTAAAACCTGGTGAACTA-3’，反向引物：5’-TTGGAAGTTCTATTGGCAGAAC-3’，探针：5’-FAM-ACTGCTAGAAGTTGATAACCGAGTC-TAMRA-3’[5]。引物和探针由Invitrogen公司合成。每个样本重复3次qPCR反应。双蒸水作为阴性对照。2-ΔΔCt方法即ΔΔCt=（CtCOXⅡ-CtGAPDH）测试组-（CtCOXⅡ-CtGAPDH）对照组分析数据 1.5 mtDNA D-loop区的克隆和测序 PCR扩增肝组织和肝细胞DNA的mtDNA区。每个反应用10 ng基因组DNA作为模板。mtDNA D-loop区PCR引物对：F1：5’-CTAATACCTTTCCTTCATACCTCAA-3’；R1：5’-ATTTTGGGAACTACTAGAATTGATC-3’；F2：5’-CAACCAGTAGAACACCCATTTATTA-3’；R2：5’-TGTCTTTCAAGTTCTTAGTGTTTTT-3’。双蒸水为阴性对照。PCR产物克隆于pGEM-18T载体。ABI 3730基因分析仪器对每个样本随机选择的10个克隆测序 1.6 序列分析 Vector NTI套件7.0 Contig Express软件包对每个克隆的核苷酸序列组装并纠错[8]。Clustal W多序列比对程序比对序列与参考序列（NC_005089.1，GenB