ESBLs菌株的检测方法.doc

ESBLs菌株的检测方法： 　　目前检测ESBLs的常用方法有双纸片协同试验（即阿莫西林双纸片协同试验与替卡西林双纸片协同试验，以NCCLS纸片表型确证试验测定结果为标准，筛选出产ESBLs）、纸片表型确证试验、琼脂稀释法确证实验、三维试验等。 一、纸片扩散法检测ESBL 　　1.筛选试验:选用头孢泊肟、头孢他啶、氨曲南、头孢噻肟或头孢曲松(每片含量均为30μg)药敏纸片中的至少2种,用苗勒-欣顿(MHA)琼脂,标准纸片扩散法测试抑菌环直径,按美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)1997年标准进行判断。凡头孢泊肟或头孢他啶的抑菌环直径≤22mm,头孢曲松≤25mm,氨曲南或头孢噻肟≤27mm,均应高度怀疑为ESBLs菌株,应进一步作确认试验来加以确诊。 　　2.确认试验:用头孢他啶(每片30μg)和头孢他啶加克拉维酸(30μg和10μg);头孢噻肟(每片30μg)和头孢噻肟加克拉维酸(30μg和10μg);分别测量2种纸片单独及加克拉维酸的抑菌环直径。加克拉维酸和不加克拉维酸的抑菌环直径≥5mm可确认为ESBLs菌株。 　　质控菌株:大肠埃希菌ATCC25922(头孢他啶:头孢他晓+克拉维酸≤2mm; 　　肺炎克雷伯菌ATCC700603(头孢他啶:头孢他啶+克拉维酸≥5mm)。 二、检测ESBLs最低抑菌浓度(MIC) 　　1.筛选试验:选用头孢泊肟、头孢他啶、氨曲南、头孢噻肟或头孢曲松至少2种以上,用阳离子增强的MH肉汤(标准肉汤稀释法)稀释至1mg/L,凡被测菌在上述各管中能够生长(MIC≥2μg/ml),均应高度怀疑为ESBLs,应进一步作确认试验来加以确诊。 　　2.确认试验:用标准肉汤稀释法测定MIC的方法,按NCCLS(1997)推荐的筛选和确认ESBLs的标准进行判断。选用头孢噻肟单独稀释(范围0.25~64mg/L)及头孢噻肟(稀释范围相同)加克拉维酸(每管4mg/L);头孢他啶单独稀释(范围0.25~128mg/L)及头孢他啶加克拉维酸(每管4mg/L),上述2种药物必须同时进行试验,结果加克拉维酸和不加克拉维酸的MIC差值如≥8倍(3个稀释度),可确认为ESBLs菌株。质控菌株:大肠埃希菌ATTC25922(头孢他啶:头孢他啶+克拉维酸8倍);肺炎克雷伯菌ATCC700603(头孢他啶:头孢他啶+克拉维酸≥8倍)。 三、用于ESBLs筛选的特殊试验 　　1.在MicroScan的一些药敏试剂条中包括了头孢泊肟、头孢他啶或氨曲南,且每种试剂条均有2种指示药物,当被试菌对这些指示药物的MIC≥2mg/L时,即可筛选出可疑的ESBLs菌株,符合NCCLS(1999)推荐的筛选药物组合及浓度范围,可用于ESBLs的筛选。 　　2.用浓度梯度法(Etest法)的常规试条中的三代头孢菌素或氨曲南(2种以上),凡MIC≥2mg/L时,即高度怀疑为ESBLs,应进一步作确认试验来加以确诊。现有2种Etest法的ESBLs确认试条,分别是头孢噻肟及头孢噻肟加克拉维酸、头孢他啶及头孢他啶加克拉维酸。检测结果加克拉维酸和不加克拉维酸的MIC差值≥8倍（3个稀释度）,可确认为ESBLs菌株。 　　Etest检测ESBLs的具体操作步骤是 　　(1)在常规试验中选出对三代头孢MIC≥1mg/L的菌株(比NCCLS的标准低一个稀释度); 　　(2)按NCCLS(1999)推荐的方法,用2种底物筛选和确认ESBLs(筛选试验:在头孢噻肟或头孢曲松中选1种,头孢他啶或氨曲南中选1种。 　　确认试验:用头孢噻肟和头孢他啶); 　　(3)确认该菌对头孢西丁的MIC≤8mg/L,以排除质粒AmpC酶; 　　(4)再测定该菌对其他非β内酰胺抗生素的药敏模式,以指导抗菌治疗或收集流行病学资料。 四、其他检测方法(非NCCLS推荐的方法) 　　1.双纸片扩散法:药敏平板和菌液的制备方法与常规药物敏感试验相同,将菌液涂布在，MH琼脂平板上,贴上药敏纸片,1张为三代头孢菌素(头孢他啶、头孢噻肟或头孢曲松)或氨曲南,1张为含有β内酰胺酶抑制剂(克拉维酸10mg/L)的纸片,两纸片相距20~30mm(中心-中心),35℃孵育18~24小时,观察结果。如显示协同为阳性。 　　2.三相扩散法:该法又有直接法和间接法2种。直接三相扩散法是在纸片扩散法的基础上略加改动,首先按标准纸片扩散法进行操作,贴上药敏纸片,在离纸片3mm处打一个小孔(靠近平板中央一侧),内加200μl浓度为105~106的菌液,35℃孵育过夜,如在头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松或氨曲南周围的抑菌圈形状发生改变,试验为阳性。如果在上述抗生素周围的抑菌圈很小或没有抑菌环,应该用间接法重复。间接三相扩散法与直接法不同在于,直接法平板表面涂布的细菌和小孔内的细菌是相同菌,而间接法平板表面涂布的细