生化实验技术与方法.ppt

糖的薄层层析 ; 实验原理 层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。 ; 固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。 流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。 ;按操作形式不同分类： 柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。 纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。 薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。 ;按机理分类： 吸附层析 分配层析 离子交换层析 凝胶层析 亲和层析 ; 薄层层析是一种微量而快速的层析方法。该法是把吸附剂或支持剂涂布在玻璃板上成为一薄层，将要分析的样品滴加到薄层上，然后用合适的溶剂进行展开，使样品各个成分分离，然后进行定性鉴定和定量测定。 ;实验操作 硅胶薄板的制备：注意胶要均匀。 1.2 g硅胶H加4.0 ml0.5%CMC溶液，研磨数分钟后，倒在预先准备好的玻璃板上，铺开，使浆液分部均匀，放在水平台上，自然晾干。;2. 板的处理： 薄板的活化：105℃，0.5h 薄板的刮分：径向层析的优点是：样品展层后图谱呈弧形带状，使Rf值相近的化合物也能清楚地分开。 3. 点样：样品为鼠李糖、木糖和葡萄糖。点样量8-10μl。注意：点样点的直径小于5mm，点样要少量多次，吹风机风力不能过大。 4. 展层：展层溶剂为：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=12：3：3：2（体积比），新鲜配制。 5. 显色：显色剂：苯胺-二苯胺-磷酸试剂。;20mm;;苯丙氨酸解氨酶的提取纯化 ;实验原理 苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine：ammonia lyase，简称PAL；EC4.3.1.5）是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切有关，在植物正常生长发育和抵御病菌侵害过程中起重要作用。 本次实验是以银杏叶为原料采用分步盐析、透析脱盐、离子交换等方法得到苯丙氨酸解氨酶。; 离子交换层析法主要是利用溶液中各种带电离子与离子交换剂之间的结合力的差异进行的分离方法。各种氨基酸分子的等电点不同，在同一pH时所带电荷不同，与离子交换树脂的结合力有差异，因此可依据结合力从小到大的顺序被洗脱液洗脱下来，达到分离的效果。 离子交换剂为固定相。 带电离子与离子交换剂之间的作用力主要是静电力，它们的结合是可逆的。 ;离子交换剂由基质（惰性不溶性载体）、电荷基团（功能基团）和反离子（平衡离子）三部分组成。 纤维素-O-CH2-COO--Na+ 基质 电荷基团 反离子 ;离子交换剂的种类;　　　　聚苯乙烯-苯二乙烯是由苯乙烯（单体）和苯二乙烯（交联剂）进行聚合和交联反应生成的具有网状结构的高聚物。它是离子交换树脂的基质，带电基团是通过后来的反应引入基质的，树脂一般都制成球形颗粒。 ;从交换剂上洗脱目的物的方法有两种： 1.调节洗脱液的pH，使目的物在此pH下失去电荷甚至带相反电荷。 2.用高浓度的同性离子，将目的离子取代下来。 ;仪器 高速冷冻离心机；恒温水浴；电子天平；柱层析系统等 试剂 0.1mol/L硼酸-硼砂缓冲液（含1mmol/LEDTA、20mmol/Lβ-巯基乙醇） 固体硫酸铵 0.01mol/LTris-HCl（pH8.8）缓冲液）； DEAE纤维素52;操作步骤 酶的提取 （1）植物材料2g，剪成小段，加入5倍体积的酶提取液，于冰浴上用研钵研磨。 （2）将已匀浆的酶液转入离心管，4000r冷冻离心30min。 （3）取离心后的上清液（酶粗提液），量出其体积，留样 0.5ml 。;硫酸铵分级沉淀酶蛋白 （1）根据实际体积、温度和硫酸铵饱和度用量表，算出达到38%饱和度应加入酶粗提液中的硫酸铵量，并称硫酸铵。（240g/L) （2）将酶液倒入烧杯内，边缓慢搅拌边缓慢加入称好的固体硫酸铵，待全部加完后，再缓慢搅拌10min；然后于9000r离心15min，保留上清液于烧杯内。 （3）根据硫酸铵饱和度用量表，算出从38%到75%饱和度所需硫酸铵用量。