体外与转录试剂盒说明书.docVIP

使用试剂盒时所有的试剂要放置在冰上 转录反应步骤和孵育 解冻冷冻的试剂 把RNA聚合酶混合物放置在冰上，它在甘油中保存，没有被保存在-20。 vortex10×reaction buffer和2×NTP/CAP至完全溶解，一旦解冻，反应过程中把 2×NTP/CAP放在冰上，10×reaction buffer保存在室温， 所有的试剂在打开之前都应该短暂的微微离心，以防丢失或污染到离心管边缘的物质。 室温下转录反应 如果反应在冰上进行，10×reaction buffer中的亚精胺可以与模板中的DNA共沉淀， 离心管中加入水和核苷酸后再加入10×reaction buffer。 以下是一个20ul的反应体系，可按需要放大或缩小。 当RNA长度为300base-5kb时采用以下反应体系 (用0.1-0.2ug PCR产物模板 或0-1ug线性质粒模板） 对于更长或更短的转录，参考20页的“Optimizing yield of long transcripts’’和“Optimizing yield of short transcripts”部分。 当合成转录的长度大于5或6KB时，限制GTP生成率，会导致产量降低、过早终止转录。为了避免这种情况，可能需要补充额外的GTP支持反应。下面是添加特定体积的GTP对普通转录反应的影响。 （对于T7和T3试剂盒，提供的GTP为30mM。对于SP6，为20mM.） 应该添加多少额外的GTP? 对于5-8KB的长度，我们建议最初测试加入1ul的GTP，对于更长的模板应该试试滴定额外的GTP确定所需的最小值。添加GTP将减少转录合成加帽的比例，但将引起产量升高。加帽转录的比例与反应中GTP中CAP的模拟物的比率成正比。 RNA产量与良好的加帽效率之间的平衡 在网织红细胞溶解物中，我们测试了GTP不同比例的CAP模拟物对转录反应的RNA产量和产生RNA的翻译效率的影响。（表1） 网织红细胞球蛋白的RNA的翻译依赖于CAP。随着GTP的CAP模拟物增加，RNA的产量减少。相反，合成的RNA的翻译效率随着模拟物的比率增加而增加，这反映了5’端加帽的转录的增加。注意GTP的CAP模拟物为4:1时提供了一个很好的RNA产量和加帽效率的平衡。没有加帽的转录在爪蟾卵母细胞的显微注射实验中不会出现问题。这些未加帽的转录很可能迅速的被卵母细胞降解。 除了加入不同比率的m7G(5)ppp(5)G，T7-mMESSAGE mMACHINE 反应在标准条件下进行。使用1ug的T7球蛋白模板DNA 37度孵育1h。球蛋白RNA (6 μg/mL)在25ul的Retic Lysate IVT?进行翻译，加入12.5 μCi of [35S]蛋氨酸(1200 Ci/mmol)，30°C反应 60 min 。测量TCA-可沉淀 cpm 的量。 彻底混匀 轻弹离心管或用移液器上下轻轻吹打混匀混合物，短暂低速离心，收集管底的反应混合物。 4. 37度孵育1hr 一般来说，孵育1h后可获得80％℃孵育15min。 DNase处理可清除模板DNA，对一些应用来说并不必要，因为相对于RNA来说，模板DNA的浓度非常低。 加入1ul TURBO DNase,混匀 37℃孵育15min RNA的回收 转录反应后所需要的净化程度取决于RNA的用途。以下是四种不同的方法，根据你的用途选择一种或多种。 MEGAclear? Kit 此试剂盒专为体外转录合成高产量的RNA的纯化所设计。快速、简单的去除RNA中的核苷酸、短的寡核苷酸、蛋白。回收的RNA可用于任何需要高纯度RNA的实验。 氯化锂沉淀 氯化锂沉淀法是一种简单有效的可除去未合成的核苷酸和大部分蛋白质。但它并不沉淀转移的RNA，也不沉淀小于300核苷酸的RNA。同时，为了保证沉淀效率，RNA的浓度至少应在 0.1 μg/μL。 mMESSAGE mMACHINE?反应获得的RNA产量相对较低，下面第一步加LiCL沉淀液之前不用水稀释转录产物 加入30ul Nuclease-free水、30ul LiCL沉淀液，终止反应，沉淀RNA。 彻底混匀，-20℃冷却30min。 4℃ 最大速度离心15min to pellet RNA 小心移去上清，用1ml 70％℃下冷却混合物至少15min,4℃下最大转速离心15min，得到RNA沉淀。小心去除上清，按照需要用合适的水或buffer溶解DNA。 e. Store frozen at –20°