土壤中脱氢酶活性测定-TTC分光光度法.docVIP

土壤中脱氢酶活性的测定 殷晓晨，武亨杰，朱承彬 （中国石油大学 化学化工学院，山东 青岛266555） 摘要：为了研究土壤中微生物降解有机物的能力，设计实验，采用TTC分光光度法测定受石油污染并接受生物修复的各土壤样品中脱氢酶的活性。研究表明，所采集的土壤样品中脱氢酶的含量很少，基本无法用本方法检测出，说明土壤在过去的一年里发生了某些变化使脱氢酶含量降低。 关键词：土壤；脱氢酶；TTC；紫外分光光度法 中图分类号： X705 文献标志码：A Measurement of Catalase Activity in Soil Yin Xiao-chen, Wu Heng-jie, Zhu Cheng-bin （College of Chemistry and Chemical Engineering, China University of Petroleum，Qingdao266555，China） ultraviolet spectrometry. The research shows that the content of dehydrogenase in soils samples are so minute that cannot be detected by this method. Key words: soil; dehydrogenase; TTC; ultraviolet spectrometry . 土壤中的微生物对于有机物的降解，实质上是微生物经过一系列的酶的催化作用下的生物氧化还原反应。参加生物氧化的重要酶为氧化酶和脱氢酶二大类，其中脱氢酶类尤为重要。其中脱氢酶能使氧化有机物的氢原子活化并传递给特定的受氢体实现的氧化和转化。如果脱氢酶活化的氢原子被人为受氢体接受，就可以通过直接测定人为受氢体浓度的变化间接测定脱氢酶的活性，表征生物降解过程中微生物的活性。因此，脱氢酶的活性可以体系内活性微生物量以及其对有机物的降解活性，以评价降解性能。脱氢酶活性测定方法有MB.2H定性分析法和TTC比色法，目前用得较多的为氯化三苯基四氮唑（TTC）比色法。利用TTC作为人为受氢体， 实验 实验器材 本实验所用器材为721分光光度计，比色皿，三角瓶，容量瓶，漏斗，滤纸等。 1.2 试剂 1mg/mL TTC溶液（绘制标准曲线）：称取0.5gTTC，溶解，定容至500mL； 1% TTC溶液（土壤测定）：取1g TTC，溶解，并定容至100mL容量瓶中； Tris-HCl缓冲溶液（pH=7.6）：称取6.037g Tris（三强甲基氨基甲烷，分析纯），再加入1mol/L的盐酸，调pH值为7.6； 1.3土壤样品 本实验土壤样品取自于受石油污染并接受生物修复的位于东营市的土壤，共有14个土壤样品。 1.4 实验方法 1.4.1 TPF标准曲线的绘制 配制系列浓度的TTC标准溶液：取8个50mL容量瓶，分别吸取0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、3.5mL 1mg/mL TTC溶液加入以上容量瓶中，用蒸馏水定容。 绘制标准曲线：取8支具塞试管，分别依次加入2mL Tris-HCl缓冲溶液（pH=7.6）、2mL蒸馏水和2mL不同浓度的TTC标准溶液（空白对照用蒸馏水代替TTC溶液）。然后分别加入0.1g低亚硫酸钠（保险粉），振荡摇匀。待充分显色后，加入5mL甲苯，振荡萃取微红色的TPF，上清液于485nm处测定吸光度值。 以TPF的浓度为横坐标，以吸光度A值为纵坐标绘制标准曲线。 1.4.2 土样测定 分别取5g 过1.25mm筛的新鲜土壤样品于具塞三角瓶中，每个三角瓶加入2mL1%的TTC溶液，2mL蒸馏水，充分混匀。置于37℃恒温箱中避光培养6h。培养结束后，加入5mL甲醇，剧烈震荡1min，后静置5min，再振荡20s，然后静置5min。将三角瓶中的物质全部过滤到比色管中，并用少量的甲醇洗涤三角瓶2-3次，洗涤液也全部过滤到比色管中，定容到25mL，于485nm下测定吸光度值A，以每g干土生成的TPF为脱氢酶的一个活性单位。 结果分析 表1 标准曲线绘制数据表 C(TTC)/(ug/ml) 空白 10 20 30 40 50 60 70 C(TPF)/(ug/ml) 0 3.59 7.18 10.77 14.36 17.95 21.54 25.13 吸光度 A 0.000 0.127 0.233 0.331 0.434 0.538 0.648 0.754 例：1号TTC溶液C(TPF)/(ug/ml)=10ug/ml*2ml*300.46/(334.8*5ml) 绘制的标