流式细胞术原理2010-12-21.ppt

流式细胞术的原理 BD生物科学 王淑琦 样本来源 血液 骨髓 淋巴结 体液 （尿液、脑脊液、胸腹腔积液） 灌洗液（肺泡支气管） 加抗凝剂（EDTA），室温保存，24h内 实体组织 机械法制备单细胞悬液，保持抗原活性，不宜用酶、表面活性剂 2.免疫荧光染色 染色方式的选择 直接染色 — 标有荧光染料的抗体直接特异结合目标抗原。 —首选的方式：方便快捷、经济、准确、非特异结合少 间接染色 —标有荧光染料的二抗间接特异结合目标抗原。 — 在直接染色不能实现的情况下，选用的方式： 非特异性结合相对增加。在流式试剂日益全面的情况下，越来越少的客户选择这种方式。仅适用于研究最新发现抗原的客户。 荧光染料的选择 1，首先，了解目标抗原 1）细胞表面抗原 2）细胞内或是核内抗原（固定、透膜步骤） 3）以上两者兼备。先标记表面抗原，固定后，破膜标记胞内抗原。 4）细胞内细胞因子的测定。使用细胞内蛋白分泌抑制剂，如monensin、BFA，使得细胞因子不能分泌到细胞外。（活化、固定、透膜） 2，了解荧光染料及其工作原理，做出准确的选择。 荧光染料的种类 荧光染料分为 三大类 1. 小分子化合物： FITC、Pacific Blue 2. 大分子荧光 蛋白：AmCyan， PerCP，PE, APC 3. 串联染料： PerCP-Cy5.5， PE-Cy5 如何正确选择与使用荧光素 仪器配置：有哪些激光器与接收通道 多色实验中，尽量减少荧光素之间的相互干扰 — 如APC与Cy5不能串联使用，两者光谱重叠大，补偿不好调。 尽量选择应用广、亮度高的荧光素 — 荧光素的强弱用Stain Index染色指数来表示，数值越大，信噪比越高。 多色实验中，亮度高的荧光素搭配表达量低的目标抗原 — 例如，PE， APC这类大分子蛋白相对亮度高。 关注F/P比值 — 尤其是使用小分子荧光素，一个抗体上会标记多个荧光素分子。 在细胞本身自发荧光强的情况下，使用发射光波长大于600nm的荧光染料。 避免使用串联染料，不稳定，可能发生降解。 BD网站提供每一种荧光素的激发以及发射光谱 常用的荧光素组合 临床应用 HIV诊断与治疗 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤的细胞周期和倍体分析 网织红细胞分析 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测 干细胞计数 残量白血病细胞检查 HLA-B27检查 血小板功能及相关疾病 * * 概念 Definition 流式细胞术 Flow cytometry (FCM) 特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析 检测的对象主要是各种生物颗粒，包括大量的临床样本：外周血，骨髓，细胞穿刺液，洗脱液，实体组织，同时包括各种各样的科研研究对象：培养细胞，藻类、染色体、原生动物 cell suspension 细胞悬液在流动的状态中被检测各项特性 流式细胞仪的基本结构 以及原理 流式细胞仪的基本结构 以及工作原理 虽然每款流式细胞仪有各自的特征性结构，但是其内部结构基本组成相同。 基本结构一共分三部分： 液流系统 光学系统 电子系统 液流系统 液流系统包括 流动室 flow chamber 液流驱动系统 Injector Tip Fluorescence signals Focused laser beam Sheath fluid 鞘液三大作用： 避免堵塞喷孔 约束样本位于喷嘴中心、提高测量精度 保持细胞活性 液流系统 对灵敏度要求不是很苛刻的实验，可调高样本进样速率，从而提高采样分析速度。 光学系统 主要由激发光源、光束成形及收集系统组成 弧光灯： 氙灯、高压汞灯价格便宜 激发光谱广 但是 单色性差-单一谱线上能量弱 稳定性差-功率不稳定 激光器： 气体激光器：氩离子（488nm）、氦氖（633nm）、氪离子（647nm）、氪氩（568nm） 半导体激光器：价格低、结构简单、使用寿命长。BD FACSCalibur采用的635nm 染料激光器 光学系统 激光器： 单波长、高能量、发散角小、高稳定性光照 光学系统 激光在检测细胞样本前经过透镜聚焦成为非常窄的高能量光束。 激光光束的横截面呈椭圆形光斑，所以除了集聚能量（细胞通过检测区时就可以得到很强的信号），这样还可以避免照射到其他细胞造成干扰。 激光光束成形-透镜聚焦 光学系统 收集系统 如何将混合的荧光区分开来，分别进行收集呢？ 滤光片置于荧光探测器前，限定其接收的荧光的波长范围 光学系统 电子系统 流式细胞仪的工作原理 散射光信号 前向角散射光（FSC，Forward Scatter）： 细胞相对大小及其表面积 侧向角散射光（SSC，Side Scatter）： 细胞颗粒度及细胞核相对复杂性 散射光信号 荧光信号 特异荧光信号 背景信号