植物细菌诱导型表达载体构建.pdfVIP

2006 年 12 月 湛江师范学院学报 Dec ,2006 　　第 27 卷 第 6 期 JOURNAL OF ZHANJ IANG NORMAL COLLEGE Vol 27 　No 6 植物细菌诱导型表达载体的构建 1 2 2 2 曾　骥 , 黄真池 , 刘 　媛 ,黄永莲 ( 1. 湛江师范学院 自然科学与技术研究中心 ,广东 湛江 524048 ; 2. 湛江师范学院 生命科学与技术学院 ,广东 ,湛江 524048) 　　摘 　要 : 根据 GenBank 中细菌诱导型启动子 的碱基序列设计一对 引物 , 通过 PCR 扩增 出启动子 PPP3 (AF469483 ,220bp) . 经分子操作将启动子和质粒 pUC18 连接后转化 E . coli DH5α,经蓝 白筛选和 PCR 检测筛选阳性 ( ) 菌落 ,测序结果与 Genebank 中的碱基序列完全相同. 对扩增到的 PPP3 片段和含 目的基因 hrap 或pflp 的pBI121 质 粒进行双酶切 ,分别回收 PPP3 片段和含 目的基因的pBI121 大片段 ,连接后转化 E . coli DH5α,通过卡那霉素抗性筛 选和 PCR 检测 ,表明细菌诱导型启动子和 目的基因已正确连接. 用重组质粒转化农杆菌 ,经卡那霉素抗性筛选和 PCR 检测 ,证明植物细菌诱导型表达载体构建成功. 关键词 :细菌诱导型启动子 ; hrap ; pflp ;植物细菌诱导型表达载体 ( ) 中图分类号 :Q946 　　　　文献标识码 :A 　　　　文章编号 :1006 - 4702 2006 06 - 0071 - 04 [1 ] 目前 ,世界上已经报道的植物细菌性病害有 500 多种 ,对农林业生产造成了巨大损失 . 传统育种方法 虽然能利用作物本身或亲缘种的抗性基因选育抗病品种 ,但存在着可利用的抗性品种资源少 ,选育时间长 , 耗资大等缺点;施用化学药剂来防治细菌病害并非完全有效 ,而且污染环境. 近年来植物基因工程技术的不 断发展以及对植物和病原物相互作用的深入了解使得将外源抗性基因导入植物来提高抗病性成为一条有效 途径. 通过转基因技术可以打破传统育种中的种间不亲和现象 ,消除杂交障碍 ,极大地拓宽了抗性基因的来 源和应用. 目前利用基因工程技术提高作物抗病性的研究主要集中在阻碍病原菌间的信号交流 ,通过 RNA 干涉抑制病原菌关键致病基因的表达 ,转入无毒基因或无毒基因簇 ,利用强启动子或转录因子促进抗病相关 基因的表达等来提高植物抗病力[2 - 5 ] . 但实践证明 ,抗性基因的高效表达虽然提高了植物的抗病力 ,但由于 外源基因在植物体内的持久的高水平表达 ,植株会因能量过多耗损 、而生长缓慢 、畸变 ,甚至死亡[1 ,4 - 6 ] . 为了 避免这些不足 ,在转基因中使用诱导型启动子是理想的基因工程策略. 病原微生物侵染植物后 ,通常会引起植物体内活性氧的爆发 ,进而诱发超敏反应. 超敏反应是一种快速 的局部组织坏死 ,从而阻止病原物的传播 、扩散[7 - 9 ] . 据一系列文献报道 ,从甜椒中克隆到的 pflp 基因能改变 植物细胞中活性氧的水平 , hrap 基因能协助一些超敏反应激发子增强超敏反应 ,而两种基因同时表达可以 大大提高植物的抗病力[10 - 11 ] . 彭建令等[12 - 13 ] 报道从烟草中克隆到