第07章抗原抗体反应及应用.ppt

第七章 抗原抗体反应及应用 本章提要 抗体的制备与应用 抗血清的制备 单克隆抗体的制备 基因工程抗体 催化性抗体 单抗的医学应用 抗原抗体反应 抗原抗体反应原理 抗原抗体反应特点 常见免疫分析方法 沉淀反应 凝集反应 免疫标记技术 补体参与的抗原抗体反应 免疫分析灵敏度 本章小结 课后思考题 7.1.1 抗血清的制备 抗原的准备 免疫动物 动物的选择 免疫途径 免疫剂量与周期 动物采血法 抗血清的纯化与保存 抗血清的鉴定 抗血清与多克隆抗体 抗血清(antiserum)：用抗原人工免疫实验动物，可获得含有特异性抗体的血清，称为抗血清。 多克隆抗体(polyclonal antibody)：抗血清中抗体是多个抗原决定簇刺激不同B细胞产生的抗体，所以称为多克隆抗体。 抗原的准备 半抗原与载体偶联制备完全抗原 常用的连接反应及双功能连接剂 佐剂的使用：佐剂与抗原按1：1比例混合乳化 动物的选择 抗原与免疫动物的种属差异越远越好。 对蛋白质抗原，大部分动物皆适合常用的是山羊和家兔；甾体激素免疫多用家兔；酶类免疫多用豚鼠。 抗血清量的需要：大动物如马、骡等可获得大量血清（一头成年马反复采血可获得10000ml以上的抗血清）；但有时抗体需要是不多，选用家兔或豚鼠即可。 免疫途径 一般采用多点注射，一只动物注射总数约为8~10点，包括足掌及肘窝淋巴结周围，背部两侧、颌下、耳后等处皮内或皮下，免疫效果较好；亦有肌肉、腹腔、静脉注射途径。 腹腔、肌肉、皮内、皮下注射适合使用任何抗原，刺激局部淋巴结发生免疫应答； 静脉注射适合可溶性抗原及分散的单细胞悬液，不使用佐剂，免疫应答主要发生在脾脏。 免疫剂量与周期 免疫剂量： 抗原用量视抗原种类及动物而异，一般大动物抗原剂量（以蛋白抗原为准）约0.5~1mg/只，小动物约0.1~0.6mg/只。 免疫周期： 初次免疫后，再经2～3次以上的加强免疫，一般3～4周间隔适合大部分动物，小动物10～14天，大动物2月左右。 动物采血法 颈动脉放血法：这是最常用的方法，对家兔、山羊等动物皆可采用。 心脏采血法：此法多用于豚鼠、大鼠、鸡等小动物。此法采血技术应熟练，穿刺不准容易导致动物急性死亡。 静脉多次采血法：家兔可用耳中央静脉，山羊可用颈静脉。这种放血法可隔日一次，有时可采集多量血液。 抗血清的纯化与保存 试血、采血：加强免疫后2－3次，可通过耳静脉或眼球采血，进行抗血清效价测定，当效价达到理想高度，可以心脏直接采血或动脉放血。待血凝后用针筒或吸管吸取血清。 抗血清纯化：盐析、层析(离子交换、分子筛、亲和层析)。 保存：低温冻存，冻干、加保护剂（叠氮化钠NaN3或BSA）4℃保存。 抗血清的鉴定 效价鉴定： 效价又称滴度（titer），是表达抗血清中特异性抗体相对含量的一个半定量指标，即在一定条件下结合一定量抗原的抗血清的稀释度。 亲和力鉴定： 亲和力（affinity）指抗血清与相应抗原结合的强度，是描述抗体特异性的重要指标，常用亲和常数K表示。 抗体特异性鉴定： 常用琼脂双扩散法鉴定抗体特异性。 7.1.2 单克隆抗体的制备 单克隆抗体（monoclonal antibody，MAb）——由单一B细胞克隆合成并分泌的一种组成均一的免疫球蛋白分子，简称单抗。 单抗制备的原理 单抗制备的材料 单抗制备的技术 单抗制备流程图 单抗制备的原理 MAb是单一B细胞克隆产生的，其特异性是针对一个抗原决定簇的，它是B细胞克隆的标志。 为使B细胞在体外能长期存活，Kǒhler和Milstein于1975年创建了杂交瘤方法。其基本原理是：将分泌抗体但不能长期培养的B细胞与能长期体外培养但不能分泌抗体的瘤细胞融合，筛选出既能分泌抗体又能长期体外培养的杂交瘤细胞，然后单克隆化，并扩大培养，从而进行单抗生产。 单抗制备的材料 骨髓瘤细胞： 不产生抗体或产生抗体的某种链但不分泌 次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK）的缺陷型 B细胞——小鼠或大鼠脾脏 融合剂——50%的聚乙二醇（PEG）或电脉冲 HAT选择培养基——含10%-20%小牛血清和HAT的RPMI1640） 单抗制备的技术 抗原提纯与动物免疫 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 细胞融合 HAT法筛选杂交瘤细胞 阳性细胞的筛选、单克隆化与保存 单克隆抗体的制备与纯化 抗原提纯与动物免疫 抗原纯度越高越好，尤其是初次免疫抗原。 选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c（巴比塞）健康小鼠，鼠龄在8~12周，雌雄不限，可同时免疫3~4只小鼠。 免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同，因动物、抗原形式、免疫途径不同而异，以获得高效价抗体为最终目的，免疫间隔一般2~3周。 末次免疫后3~4天，取出脾脏组织，制成单细胞悬液。 骨髓瘤细胞与饲养细胞的制备