mRNA提取和荧光定量PCR.ppt

RNA的抽提 一、概述 Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，裂解细胞并释放出RNA,酸性条件使RNA与DNA分离,加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。 二、试剂 1.DEPC水： 1ml＋1000ml双蒸水＝1‰ DEPC水，1000ml容量瓶中静置4小时。 2.75%乙醇：无水乙醇+DEPC水，-20℃保存（DEPC水需先高压） 3.氯仿：棕色瓶 4.异丙醇：棕色瓶 三、操作步骤 一、抽提 （一）组织抽提 （二）细胞抽提 1.倒掉培养基，PBS洗，直接将1ml Trizol 注入培养瓶（5×106），反复抽吸均匀。 2.或收集细胞后加入Trizol 反复抽吸均匀。 三、操作步骤 二、分相 3.在装有裂解物的离心管中加入0.2ml的氯仿(为Trizol总体积的1/5),振荡混均30秒，室温下静置5分钟. 4. 12000 rpm 15分钟4?C,分相为三层。上层：RNA(约为Trizol的60%)；中间：DNA；下层:蛋白质(酚-氯仿)。 5.小心吸取上清液，转移到另一EP管中。1ml裂解物产生的上清液体积约为0.4～0.6 ml。有机相和中间层含有DNA和蛋白质,避免触及。 三、操作步骤 三、RNA沉淀 6.上清液加入约0.5ml的异丙醇,振荡混均30秒。室温下静置10分钟。 7.离心12000rpm 10分钟4?C。 8. RNA沉淀将在离心底的侧面形成。小心吸弃上清液,注意避免吸弃RNA沉淀。 三、操作步骤 四、RNA清洗 9.离心管加入1ml 预冷的75%乙醇(1mlTrizol至少1ml乙醇清洗DNA),振荡混均30秒，使沉淀振荡起来，室温12000rpm×1～2分钟。（有文献称不超过7500g离心）。尽可能吸弃上清液,防止RNA沉淀丢失。重复以上清洗步骤一次。在75%乙醇中，RNA在4℃至少保存1周，－20℃至少保存1年。 10.室温选择流动性小，倒置离心管于滤纸上，干燥RNA，但不能完全干燥(5～10分钟)。用DEPC水15μl溶解沉淀，55-60℃孵育10～15分钟。 11.测量OD值后，样品放置－70℃保存，一个月 注意事项 1..电泳检测: 制备甲醛变性，1％琼脂糖凝胶快速电泳，25ug/lane，65V，2.5h，检测RNA分子完整性，观察18S、28S条带。 2. RNA沉淀完全干燥，会极大地降低可溶性。部分溶解的RNA其A260/280比值1.6。用移液管尖分几次移取无RNA酶的水或0.5% SDS溶解RNA，并在55～60°C下孵育10分钟，当RNA以后要用于酶切反应时，避免使用SDS。 3..分离RNA的理想效果是A260/A280=1.8～2.0 【分离胶范围】＜500bp 1.2～1.5％ ＞10 kp 0.3～0.7％ 二者之间 0.8～1.0％ 【分析和定量】紫外分光光度计测定A260及A280来定量分析RNA的纯度及浓度。用什么稀释的RNA，就用其调零。 注意事项 5.预防RNA酶污染 6.在分相步骤吸取上清液过程中，和清洗步骤吸弃上清液过程中，都应在不触及其他相或沉淀的前提下吸取尽可能多的上清液。 7.台式离心机最大能达到2,600×g的离心力，如果将离心时间延长到30-60分钟可以满足操作。 8.当TRIZOL用量少于2ml时建议使用清洁的一次性的聚丙材质试管。TRIZOL用量较大时，可以使用玻璃试管(Corex)或聚丙材质试管，事先检验以确保该试管可以耐受加入TRIZOL和氯仿后12,000×g的离心力。不可使用有裂缝或者破损的试管。 离心前小心平衡试管。离心前玻璃管口必须盖上铝箔并用石蜡膜封口，聚丙烯管必须盖紧。 荧光定量PCR 一、原理 FQ-PCR的工作原理是利用Taq酶的5’→3’外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记探针。该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5’端标以荧光发射基因FAM（6-羧基荧光素，荧光发射峰值在518nm处），靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA（6-羧基四甲基若丹明，荧光发射峰值在582nm处），探针的3’开端被磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。当探针保持完整时，淬灭基团抑制发射基团的荧光发射。发射基团一旦与淬灭基团发生分离，抑制作用被解除，518nm处的光密度增加而被荧光探测系统检测到。复性期探针与模板DNA发生杂交，延