第五章个别细胞与组织的培养.pdfVIP

第五章 个别细胞和组织的培养 在培养特定组织时，尤其来自成体和分化较高的细胞，所采用的培养技术措施不能完全相同，否则难 以获得理想效果。当前体内能培养的组织细胞极多，也难一一详述，今仅就常用和有代表性一些细胞的培 养，分正常细胞和肿瘤细胞培养两大类介绍。为叙述方便，对正常细胞的介绍是按组织学分类层次，同时 也照顾到胚层起源。因基本培养技术仍大同小异，为避免重复，在介绍中只侧重于个别组织细胞培养的要 点和特点，一般过程不再重叙；培养对象以人和哺乳动物细胞为主。 第一节 正常细胞培养 正常细胞，不论是来自人或动物的细胞，在体外培养时都不易生长，建立细胞系更难。正常细胞难培 养的原因是因它们是分化的细胞，对体外生存条件要求严格，目前的培养条件尚未能模拟到与体内完全一 样，故难生长，尤其难于维持在体外长时间增殖生长 (呈细胞系状态) 。但正常细胞在体外并非不能培养， 只要一切条件适当仍有培养成功可能；初代培养较传代细胞系容易。 迄今，正常细胞除成纤维细胞系 (动物和人) 、人羊膜细胞外，其它细胞系尚不多见。现有大量细胞系 主要为肿瘤和杂交瘤细胞。但如正常细胞发生转化后，便易生存下去，证明正常细胞难以培养的原因主要 与细胞分化相关。 一、上皮细胞类培养 上皮细胞可来源于外、内、中三个胚层；但培养中只有源于外和内胚层的细胞能反映出上皮细胞的特 征，细胞呈膜状生长的特点。而间皮和内皮刚接种培养和细胞量少时常呈成纤维细胞型，只有细胞数量较 多时，才能显出膜状特点。 上皮细胞培养有三个难点：①需求特殊底物，如在底物上涂有胶原底层则利于细胞生长；②需求特殊 培养基；②与上皮细胞相邻的成纤维细胞常与上皮细胞同时混杂生长，并常压过上皮细胞。 纯化和延长上皮细胞生存期是上皮细胞培养的关键之一。癌起源于上皮组织，因此上皮细胞培养特别 引人注意。 (一)表皮细胞培养 1．要点： 利于皮肤表皮细胞培养成功的因素有：在有胶原的底物上易生长；另有人发现把人或小鼠表皮细胞培 养在以3T3 细胞为饲养层(用射线照射后)上时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低pH 、Ca2+ -10 -6 的含量和温度等，均利于表皮细胞生长。向培养基中加氢化可的松 (10 μg/m1)、10 的霍乱毒素、10 M 的异丙基肾上腺素 (Isoproterenol) 和10 ng/m1 促表皮生长因子(EGF) 能促表皮细胞生长。 皮肤是皮表细胞培养来源，小儿包皮是皮肤表皮细胞培养的好材料。全皮培养时，表皮细胞与成纤维 细胞混合生长，难以纯化。黑木登志夫 (1981) 用皮肤表皮和真皮分离培养法可获纯上皮细胞，有一定参 考价值，其法如下 (图7—1)： 2 ．程序： (1) 取材：取外科植皮或手术残余皮肤小块，以角化层薄者为佳，早产流产儿皮肤更好，切成0.5 ~ 1cm2 小块； (2) EDTA 处理：先置入0.02 ％ EDTA 中室温置5 分钟。 (3) 冷消化：换入0.25% 胰蛋白酶中，置4 ℃过夜； 1 (4) 分离：取出皮块，用血管钳或镊子把表皮与真皮层分开； (5) 温消化：取出表皮单独处理；用剪刀剪成更小的块后，置入新的 0.25 ％胰蛋白酶中，37℃再消化 30 ~ 60 分钟； (6) 用吸管轻轻反复吹打，使成细胞悬液； (7) 培养液：通过80 目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸上清，直接加入Eagle 液和20 ％小牛血清， 制成细胞悬液，接种入碟皿中，CO 温箱培养。 2 注意事项：冷消化目的在于使表皮和真皮结合松散；如冷消化后分离下来的表皮膜自身也已松散，此 时亦可直接置入PBS 中用吸管吹打制备细胞悬液；不再经过第二次消化。 皮肤表皮培养亦可用全皮消化法或组织块培养法培养。用胶原酶消化为好，它对结缔组织有较强消化 作用，对表皮细胞损伤小，但成纤维细胞易与上皮细胞同时生长，在这种情况下，需做排除成纤维胞处理 (见肿瘤细胞培养一节) 。血清中含有血小板