神经细胞体外培养方法及应用 - 无血清培养 .ppt

神经细胞体外培养方法及应用 田东萍 汕大医学院病理教研室 神经细胞体外培养的历史 神经组织的体外培养方法是由Harrison，于1907年首创的。 由于该方法具有简化细胞生化环境、明确生长条件、便于施加实验因素及容易获得活体直接观测结果等优点，因而已成为研究神经系统结构和功能的有效手段。 九十余年来，这项技术已从组织块（或植块）培养（explant culture）发展到分离细胞培养(dissociated cell culture)，并逐渐与多种现代技术结合起来，在神经科学各领域发挥了重大作用。 组织块培养→分离细胞培养→甚至单一型细胞培养 神经组织的植块培养法 悬滴培养方法 单盖玻方法 双盖玻方法 1925 改良双盖玻方法 培养物： CNS灰质、白质、外周神经节或神经小段 ↓ ↓ 突起 非神经元外伸 优点 所需培养液量少，可反应组织代谢中 微量生化改变 保留了植块内组织特征 不足 培养空间小，O2 CO2供少 培养空间湿度难以控制，水分会蒸发 密封手续繁杂，不利更换培养液，难 以观察单个神经元生长。 神经元的分离细胞培养方法 1956年，Nakai首创了神经组织的分离培养方法 材料来源：胚胎动物神经组织 神经元增殖发生于胚胎期 形态学分化和化学分化程度低，体外存活强，成熟后则相反，且神经元会受到大的普遍损伤。 部位：灰质、PNS神经节，神经元集中，密度大 神经元的体外培养液 天然合成成分 血清 血浆 胚胎撮液 人工培养基 无血清培养基 化学限定性培养基 常用的：DMEM + 添加剂 F12 ①葡萄糖 为神经元能量代谢主要来源 33mm ②CO2 NaHCO3缓冲系统重要 HEPESO2耗量更高 ③K+ 神经元生理活动的重要离子，K+是神经元存活所必需的，K+ 24.5mM 能提高神经元存活，促分化 ④非神经元成分的抑制 有 2-3天 神经元无血清限定培养液 人工合成的培养基虽然具备了细胞生长的基本营养物质和无机盐类，但仍无法满足不同类型细胞的特殊需要。大多数神经元在基础培养液中即使能够存活也为期不长，更难以分裂。因此可根据神经元的特性，给基础培养中再添加某些特殊物质。 选择添加剂的基本过程 ? 限定连续细胞系的体外生长条件。 试定该细胞系来源的细胞的培养 液条件。 Bottenstein实验室经过长期研究发现如下添加剂比较好 人转铁蛋白、牛胰岛素、硒酸钠、孕酮、腐胺加入到F12与DMEM 1:1混液中，可以代替血清添加物，用来培养大鼠CNS的成神经细胞瘤细胞。删去其中任何一种添加物都可导致成神经细胞瘤细胞生长状况锐减。该实验室共列出了三种神经元限定性培养添加物的配方，代号分别为N1、N2、N3。 N1的配方为 胰岛素5μg/ml 转铁蛋白5μg/ml 孕酮20 nM 腐胺100Um 硒30nM 神经体外培养的生长基质 胶 元 多聚赖氨酸 LN 神经细胞培养操作程序表 脊髓后根节 大脑皮质 孕18~20天大鼠胚胎 新生1~3天大鼠 在CMF-Hanks液中取出组织除去脑膜 ? 与CMF-Hanks 液一起移至离心管 ? 舍弃CMF-Hanks液，再加入5ml 0.25%胰蛋白酶和5滴0.2%Dnase液 ? 370C，30min ? 舍弃胰蛋白酶，加入5ml培养液和10滴Dnase液 ? 用巴斯德吸管吹打20次，再用套有微量加样器头的加样器吹打20次 ? 若有组织残渣，将上清移至新试管再加3ml培养液反复吹打 ? 将细胞悬液收集于离心管，离心1200r/min ，8min，舍去上清，向沉淀加培养液，离心1200r/min，8min ? 加入培