第二章基因操作的工具酶课件.ppt

思考题 什么是限制性核酸内切酶，它们是怎样命名的？ II型限制性核酸内切酶的基本特性有哪些？ 什么是粘性末端、平末端、同尾酶和同裂酶？ 酶的单位是怎样定义的，影响酶活性的因素有哪些？ DNA连接酶的作用特点有哪些，了解这些特点有何使用价值？ 大肠杆菌DNA聚合酶I 有哪些不同的酶活力特性，各有何利用价值。 Klenow片段和大肠杆菌DNA聚合酶I有何异同？ 为什么说逆转录酶（Reverse transcriptase）是一种特殊的DNA聚合酶，其主要用途是什么？ 举例说明在基因工程中修饰性工具酶具有重要的用途。 为什么说基因工程实际上是精细的酶学操作工程？ 1、DNA连接酶作用的机理 2、DNA连接酶的反应条件 3、DNA连接的策略 第二节 DNA连接酶及其应用 1、大肠杆菌DNA聚合酶I 2、Klenow片段 3、T4 DNA聚合酶 4、逆转录酶（反转录酶） 第三节 DNA聚合酶及其应用 1、末端转移酶（terminal transferase） 2、核酸酶SI（SI nuclease） 4、碱性磷酸化酶（Alkaline phosphatase） 第四节 修饰性工具酶 基因工程的基本步骤 基因分离酶切 载体酶切 基因和载体连接 导入细菌 重组质粒繁殖 重组克隆的选择 序列分析和基因表达等研究 导入植物细胞 DNA连接反应的条件 连接反应最佳温度为37℃，但是此时粘性末端间氢键结合不够稳定，而且酶活性也会迅速降低。比如，EcoRI 粘性末端连接部位只有4个碱基对，很容易断开。所以通常在4-15℃连接。 影响连接效率的因素有： A. 温度（最主要的因素） B. ATP的浓度( 10?M - 1?M ) C. 连接酶浓度（平末端较粘性末端要求高） D. 反应时间（通常连接过夜） E. 插入片段和载体片段 的摩尔比 转化 4℃ 过夜 加反应液 CK- 重组菌落 CK+ 1、DNA连接酶作用的机理 2、DNA连接酶的反应条件 3、DNA连接的策略 第二节 DNA连接酶及其应用 粘性末端DNA片段的连接 Nick Nick 平末端DNA片段的末端加尾连接法 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 末端核苷酸转移酶 +dATP +dTTP 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ AAAAA TTTT DNA聚合酶和 T4DNA连接酶 平末端DNA片段加接头连接法 衔接物(linker)，也叫接头，是有人工化学合成的一段10-12个核苷酸的DNA双链，其中包含有1个或几个限制性酶切位点。使用时只须将衔接物和目的片段的5′端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后用T4DNA连接酶进行连接，就可获得能产生粘性末端的DNA片段。 CCGAATTCGG GGCTTAAGCC 磷酸化 CCGAATTCGG GGCTTAAGCC P OH OH P P P OH OH T4连接酶 CCGAATTCGG GGCTTAAGCC P OH P OH EcoR I CCGAATTCGG GGCTTAAGCC AATTCGG GCC CCG GGCTTAA 第二章 基因操作的工具酶 第一节 限制性核酸内切酶及其应用 第二节 DNA连接酶及其应用 第三节 DNA聚合酶及其应用 第四节 修饰性工具酶 Genetic engineering is largely an exercise in carefully controlled enzymology. A variety of enzymes form the basic toolkit of the genetic engineer. 1、大肠杆菌DNA聚合酶I 2、Klenow片段 3、T4 DNA聚合酶 4、逆转录酶（反转录酶） 第三节 DNA聚合酶及其应用 大肠杆菌DNA聚合酶I （E。Coli DNA pol I）是Kornberg A. 1956年首先从大肠杆菌E。Coli 细胞中分离出来的。它是一种多功能性的酶，包括 3种不同的酶活力： 5′- 3′聚合酶活性 以双链DNA为模板，催化单核苷酸结合到引物的3′末端，并不断延伸。 5′- 3′外切酶活性 将双链DNA中游离的5′末端逐个切去。 3′ - 5′外切酶活性 将游离的双链或单链DNA的3′端降解。不过对于双链的降解可被5′-3′的多聚活性所抑制。 CCG GGCTATCGGA CCG GGCTATCGGA Pol I + Mg2+ A T A G CCT CCGATAGCCT GGCTATCGGA CCGATAGCCT GGCTA CCGATAGCCT GGCTATCGGA Pol I + Mg2+ CCGATAGCCT GGCTA Pol I + Mg2+ T