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***内毒素标准操作规程 1. 目 的：建立中细菌内毒素检查方法标准操作规程，规范操作。 2. 适用范围：化验室 3. 有关责任：化验室化验员对本规程的实施负责，化验室主任对本规程的有效执行承担监督检查责任。 4. 程 序： 本法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断样品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。内毒素的量用内毒素单位EU表示。 4.1试验材料及工具 分析天平 电热干燥箱（℃） 恒温培养箱型号 旋涡混合器 微量移液器 200～1000μl 50～200μl 无热源吸头 大号、小号、试管架、封口膜 鲎试剂 （应具有国家主管部门的批准文号，我公司常用湛江安度斯） 细菌内毒素检查用水（BET水） 细菌内毒素工作标准品 无热源的小试管10×75mm或无热源安瓿 无热源的小试管15×100mm及无热源的药匙 操作方法 实验准备 将所有玻璃器皿及药匙用洗液（包括三效灭活剂）浸泡4小时以上，用清水及纯化水冲洗后，置250℃箱中干0分钟以上。试验过程中应防止微生物的污染。 4.2.2 精密称定样品g于无热源的15×100mm小试管中，加置自动旋涡混合器中使样品溶解后，BET水稀释成/ml样品原液（C），置自动旋涡混合器中混和30秒。 根据L值（限值），确定样品稀释倍数 MVD= c L / λ 式中： L 为供试品的细菌内毒素限值； c 为供试品溶液浓度； λ 为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml). 例：L值为EU/mg，鲎试剂的灵敏度λ为0.25EU/ml。 EU/mg·C 2EU/mg×1mg/ml MVD= = = 16倍 λ 0.125EU/ml 吸取样品原液（浓度为1mg/ml）按如下表1稀释制得供试品溶液： 表1 L值原液=总体积吸原液 EU/g 16 0.1 ml 1.5 ml 1.6 ml 4.2.2 内毒素工作标准溶液的制备 取细菌内毒素工作标准品一支，加入1ml BET水，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟，然后制成所需浓度的细菌内毒素标准溶液（2λ）每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒。例：细菌内毒素工作标准品为50EU/支，加BET水1ml即50EU/ml，如鲎试剂灵敏度为0.25λ，那么细菌内毒素标准溶液应当为2×0.25λ=0.25λ 即0.5EU/ml。 应按以下方式进行稀释： 0.3ml 0.5ml 1ml 1ml 1ml 50EU/ml 5EU/ml 1EU/ml 0.5EU/ml 0.25EU/ml 0.125EU/ml 2.7ml 2.0ml 1ml 1ml 1ml 4λ 2λ λ 4.2.4 凝胶限度试验 在制备内毒素的同时，取鲎试剂支，λ/供试品溶液 2 供试品溶液阳性对照λ/ BET水阳性对照 BET水阴性对照加入0.1ml为供试品管加入0.1ml供试品溶液λ内毒素标准溶液为供试品阳性对照管，即（PPC管） C: 鲎试剂加0.1mlBET水复溶，再加入0.1ml 内毒素标准溶液为阳性对照管加入0.1ml BET水为阴性对照管加样结束后，封口，放入37±1℃的恒温装置内保温60±2分钟。试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°时，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（+）；凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（）小于鲎试剂灵敏度复核试验 5.1实验准备? ?玻璃器皿的洗涤将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液空干，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内，电热干燥箱。? 达到规定时间后，关断电源，待干燥箱温度自然降至室温。在不打开金属容器的 情况下，可在两天内使用；如果玻璃器皿用锡箔纸包装，在不打开包装的情况下可在两周内使用，否则须再次?除去可能存在的外源性内毒素。 5.2鲎试剂灵敏度复核 5.2.1细菌内毒素标准溶液的制备? 取细菌内毒素工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，启开过程中应防止玻璃屑落入瓶内。? 按照标准品说明书，加入规定量