荧光寿命的认识课件.pptx

荧光寿命(fluorescence lifetime) 当某种物质被一束激光激发后，该物质的分子吸收能量后从基态跃迁到某一激发态上，再以辐射跃迁的形式发出荧光回到基态。当去掉激发光后，分子的荧光强度降到激发时的荧光最大强度I0的1/e所需要的时间，称为荧光寿命，常用?表示。如荧光强度的衰减符合指数衰减的规律: It?I 0e-kt 其中I0是激发时最大荧光强度，It是时间t时的荧光强度，k是衰减常数。假定在时间?时测得的It为I0的1/e，则?是我们定义的荧光寿命。;; 如果激发态分子只以发射荧光的方式丢失能量，则荧光寿命与荧光发射速率的衰减常数成反比，荧光发射速率即为单位时间中发射的光子数，因此有?F ? 1/KF。KF是发射速率衰减常数。 ?F表示荧光分子的固有荧光寿命，kF表示荧光发射速率的衰减常数。 ;处于激发态的分子，除了通过发射荧光回到基态以外，还会通过一些其它过程(如淬灭和能量转移)回到基态，其结果是加快了激发态分子回到基态的过程(或称退激过程)，结果是荧光寿命降低。 寿命?和这些过程的速率常数有关，总的退激过程的速率常数k可以用各种退激过程的速率常数之和来表示: k?kF+?ki ki表示各种非辐射过程的衰减速率常数。 则总的寿命?为: ? ?1/k?1/(kF+ ?ki);由于吸收几率与发射几率有关， ?F与摩尔消光系数?max (单位为cm2mol-1或 (mol ?dm-3) -1cm-1)也密切相关。 从下式可以得到?F的粗略估计值(单位为秒)。 1/?F≈104 ?max 在讨论寿命时，必须注意不要把寿命与跃迁时间混淆起来。跃迁时间是跃迁频率的倒数，而寿命是指分子在某种特定状态下存在的时间。 通过量测寿命，可以得到有关分子结构和动力学方面的信息。 ;荧光寿命及其含义 （1）假定一个无限窄的脉冲光(δ函数)激发n0个荧光分子到其激发态,处于激发态的分子将通过辐射或非辐射跃迁返回基态。假定两种衰减跃迁速率分别为Γ和knr,则激发态衰减速率可表示为dn(t)/dt=- (Γ+ knr) n(t) (1) 其中n(t)表示时间t时激发态分子的数目,由此可得到激发态物种的单指数衰减方程。n(t) = n0exp(- t/τ) (2);式中τ为荧光寿命。荧光强度正比于衰减的激发态分子数,因此可将上式改写为: I(t) = I0exp(- t/τ) (3)其中I0 是时间为零时的荧光强度。 于是,荧光寿命定义为衰减总速率的倒数: τ= (Γ+ knr)- 1(4) 也就是说荧光强度衰减到初始强度的1/e时所需要的时间就是该荧光物种在测定条件下的荧光寿命。实际上用荧光强度的对数对时间作图,直线斜率即为荧光寿命倒数的负值。荧光寿命也可以理解为荧光物种在激发态的统计平均停留时间。 ;事实上当荧光物质被激发后有些激发态分子立即返回基态,有的甚至可以延迟到5倍于荧光寿命时才返回基态,这样就形成了实验测定的荧光强度衰减曲线。由于实际体系的复杂性,荧光衰减往往要用多指数或非指数衰减方程描述: I(t) = ∑αiexp(- t/τi) (5) 式中αi 为第i 项的指前因子。衰减方程的复杂性反映了体系中荧光物种的多样性或存在状态的复杂性。 ;图中有三条曲线, 分别是实际测定强度衰减曲线N(tk) 、仪器响应函数 L(tk)和拟合函数Nc(tk) 。 　仪器响应函数也被称之为光源函数,实际工作中以胶体SiO2为虚拟样品进行测定,所得到的衰减曲线就是图中的L(tk) ,光源函数表明了仪器能够测定的最短荧光寿命。 图中第二条曲线为样品的实测荧光衰减曲线N(tk) ,实际上为L(tk)与脉冲响应函数I(t)的卷积，即N(tk) = L(tk) ○I(t) (6) ;第三条曲线是实测荧光强度衰减曲线的拟合函数Nc(tk) 。利用解卷积的办法有可能得到脉冲响应函数I(t) ,进而求得描述样品荧光衰减本质的荧光寿命(τ)等有关参量。 ;分析采用非线性最小二乘曲线拟合方法,迭代过程用Marquardt法。拟合初值可由用户输入,也可对曲线粗略分析得到。如对两种衰变成分的衰变曲线,先由曲线尾部段进行单指数曲线拟合得到长寿命成分参数,再由曲线前段进行双指数曲线拟合得到(其中长寿命成分参数已得到)短寿命成分参数。 ;2.研究荧光寿命的意义 （1）荧光物质的荧光寿命与自身的结构、所处微环境的极性、粘度等条件有关,因此通过荧光寿命测定可以直接了解所研究体系发生的变化。 （2）荧光现象多发生在纳秒级,这正好是分子运动所发生的时间尺度,因此利用荧光技术可以“看”到许多复杂的分子间作用过程,例如超分子体系中分子间的簇集、固液界面上吸附态高分子的构象重排、蛋白质高级结构的变化等。 ;研究荧光寿命的意义 （3）除了直接应用之