4人工染色体构建－副本.pdf

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2017-06-03 发布于湖北
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一、人工染色体构建 1 酵母人工染色体（yeast artificial chromosome, YAC) A.W.Murray 1983年形成基础理论, D.T.Burke等1987年变为现实。 1.1 YAC的特点：（1）只能在酵母细胞中扩增。（2 ）克隆容量大，为230kb-1700kb。（3 ）构建原理，按染色体结构构建。（1）DNA复制起始点（ori ）（2 ）着丝粒（centromere，cen ）（3 ）两个端粒（telomeres，tel ） TEL ORI CEN TEL 3. YAC的组成结构（1）着丝粒区（CEN ）酵母染色体着丝粒区的保守序列: 由三个区组成 I II III A A T GTCACGTG 78-86bp TGTTTCTGNTTTCCGAAA 酵母第3、4 、6、11号染色体的着丝粒区序列： GTCACATG 84bp, 93%AT TGTATTTGATTTCCGAAAGTTAAAAA CEN3 GTCACATG 78bp, 93%AT TGTTTATGATTACCGAAACATAAAAC CEN4 ATCACGTG 84bp, 94%AT AGTTTTTGTTTTCCGAAGATGTAAAA CEN6 GTCACATG 84bp, 94%AT TGTTCATGATTTCCGAACGTATAAAA CEN11 （2 ）端粒（TEL ）两个端粒序列Tel。酵母端粒保守序列是(G T ) 重复序列。 4 2 n 人是TTAGGG重复序列; 四膜虫是GGGTTG重复序列。（3 ）复制起点（ORI ）约100bp的自主复制序列（ARS ）。（真核生物中只有酵母菌有ARS ）（4 ）克隆位点位于SUP4 基因内部。插入失活选择： TRP1 SUP4酶失活的酵 sup4 母菌落呈红色； Amp 不失活的菌落是白色。 URA3 （5 ）在酵母中的标记基因 TRP1(色氨酸) 、URA3(尿嘧啶合成) （分别位于两臂）。（6 ）在细菌中操作 TRP1 sup4 细菌的复制起点 Amp ori和抗生素标记 Ampr