急性心肌梗死患者内脏素mRNA基因表达与临床相关性研究.docVIP

急性心肌梗死患者内脏素mRNA基因表达及临床相关性的研究 　　【摘要】 目的：探讨急性心肌梗死患者内脏素基因在脂肪组织中表达情况，以及内脏素mRNA基因表达与患者临床相关性研究，为急性心肌梗死患者防治提供新的方法。方法：根据临床诊断标准将80例急性心肌梗死患者作为急性心肌梗死组，将100例正常人作为对照组。用RT-PCR方法检测内脏素mRNA的水平和基因的表达水平，并同时收集比较两组的临床检查数据指标。结果：急性心肌梗死患者组的血清内脏素浓度及脂肪组织中的内脏素mRNA基因表达均高于对照组（P 　　1 资料与方法 1.1 一般资料 选取2013年1月-2015年4月在南方医科大学南海医院腹外科100例胆石症患者作为对照组，排除一切临床心脑血管病患者；另选取2013年12月-2015年4月在广东省人民医院及南方医科大学南海医院急性心肌梗死患者80例作为急性心肌梗死组，患者均经心肌酶三项、肌钙蛋白、心电图、动态心电图及冠状动脉造影的结果确诊。排除恶性肿瘤、血液病、各种急慢性炎症期、各种急慢性心、脑血管病及其他相关的内分泌疾病 1.2 方法 1.2.1 标本留取 急性心肌梗死的患者急诊抽取静脉血5 mL，胆石症患者在术晨抽取空腹静脉血5 mL，在医院实验室高速离心机中分离研究对象的血清，分离出来的血清标本立即送检验科予FINS、血糖、FBG、甘油三酯、胆固醇、游离脂肪酸等基本临床指标测定，另一管保存在南方医科大学南海医院-80 ℃专用试验冰箱内，并分批次送广东省人民医院分子生物试验室测内脏素mRNA的水平。急性心肌梗死患者在股动脉穿刺时取腹部脂肪或冠脉搭桥时取脂肪组织液氮迅速冻存，对照组胆石症患者手术时取皮下脂肪或大网膜脂肪液氮迅速冻存，用于研究内脏素RNA提取 1.2.2 RNA提取 用通用的TRIZOL法提取，在实验室用紫外发光光度计测定内脏素RNA浓度和含量 1.2.3 内脏素基因的mRNA表达水平检测步骤 （1）研究对象内脏素基因引物的设计与合成：研究采用半定量RT-PCR方法扩增目的基因，实验对照内参照肌动蛋白基因（β-actin）。然后在PUBMED上以Genebank基因库上发布的人内脏素基因与β-actin基因的作为序列，利用国际通用的引物软件（Primer-5）设计引物。笔者得出的β-actin的两条基因扩增引物基因序列分别为5-CAGCACTGTGTT GGCGTACA-3’及5-GCTATCCAGGCTGTGCTATC-3’，扩增后基因产物的长度为495 bp。而另一个Visfatin基因的扩增引物为5-TTACATACA CACAAC ACACACCC-3，5-GCCGATTATCTTTACATAGGACG-3，基因扩增后产物为片断228 bp基因片段。（2）第二阶段，研究对象目的基因cDNA的合成：采用PROMEGA公司生产的逆转录试剂盒将特定目的的RNA逆转录合成，形成研究对象目的基因的cDNA。（3）第三阶段，采用聚合酶链反应（PCR）合成所需要的研究需要的第二条链，聚合酶链的反应体系物质如下：dNTP 2 μL（2.5 mmol/L）及β-actin基因上、下游引物各1.0 μL、Visfatin基因上下游引物各1.0 μL、 10×缓冲液Buffer（含氯化镁）5 μL、Taq酶 0.5 μL（2.5 U）、目的cDNA 2 μL、ddH2O 36.5 μL。研究的PCR的热循环条件及参数：首先预变性1 min（在94 ℃高温），反应物质变性30 s（在94 ℃高温），变性后产物退火30 s（54 ℃），在72 ℃温度时产物再延伸1 min，反复重复上述的循环，30次后，最后一次循环后在72 ℃彻底延伸时间为4 min，最后完成产物的PCR。（4）笔者把所得PCR的产物，放在自制的2%琼脂的糖凝胶电泳平板上进行PCR产物的电泳，电泳后结果最后放在美国gene电泳凝胶成像机器上观察，并用数码照相机把观察的结果的图像进行摄像，并保存原始数据，笔者采用标准β-actinDNA条带灰度及内脏素DNA条带灰度对比计算[6]。（5）所有试验对象的血清内脏素的测定采用美国专用内脏素专用试剂盒，在实验室专人化学发光法测定。FINS、血糖、FBG、甘油三酯、胆固醇、游离脂肪酸等各种临床数据生化指标测定采用放免法测定得出。（6）血清内脏素的测定，采用美国试剂盒，化学发光法测定 1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验，临床相关性的数据与急性心肌梗死的相关系分析采用多元回归相关分析，P0.05），见表1 2.2 两组内脏素脂肪组织中的分泌的内脏素RT-PCR的量比