免疫组织化学的基本理论与技术3剖析.ppt

非特异性染色 ④ 一抗的使用浓度是否过高。 ⑤ 清洗是否充分。 应严格操作规程。因在缓冲液中含有一定量的盐，这亦有利于减低背景着色，通常 0.05mol/l Tris—HCl，0.15mol/l NaCl已适用于多数染色方法，溶液内加入吐温20，效果 更佳。特殊标记时，试剂公司一般都提供缓冲液的配方。 ⑥ DBA的使用是否正确。DAB的孵育时间、配制方式、DAB保存不妥、临用前加H2O2。 ⑦ 标本染色过程中是否曾经干涸，否则会造成边缘部的非特异性染色。 ⑧ 检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应。 3 免疫组化结果分析选择着色均匀、背景很浅的高质量切片。 （1）阳性着色细胞计数法：（2）灰密度分析法：通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用图像分析仪进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。（3）评分法：通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（0-3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评分（1-4分为0-25%、26-50%、51-75%、76-100%），最终可以分数相加，再进行比较。准确判断阳性和阴性,排除假阳性和假阴性结果正确对照实验多次重复实验几种方法进行验证得到一张好的切片 * Discuss lack of focus in molecular pathology...result is low number of new products that meet the needs of the market. Nucleic Acid Testing Market Size Estimated to be $900 Million WW with growth in 2000 of 20%. Estimated by ABN AMRO Inc. Of NYC to grow by 15% annually through 2005, exceeding $1.75 Billion in market size. Abbott Laboratories acquired Vysis Inc. For $355 million in November 2001. Significant addition to Abbott’s molecular diagnostics portfolio. 2)棋盘(方阵)测定法：欲测知二种以上抗体的最佳浓度，可比较9张标本的阳性反应和背景着色。从下表可知，应采用1：20的第二抗体，并进一步在l:50～1:100之间寻找第一抗体的最佳工作稀释度。 表3-2 抗体的最佳滴度测试表 第二抗体 第一抗体 稀释度 1：50 1：100 1：200 1：20 ++++（++） ++（－） +（－） 1：40 ++（－） +（－） +（－） 1：80 +（－） +（－） +（－） 注：括号内为背景着色 (3)抗体稀释液: 0.0l mol／L PBS、Tris缓冲液 专用抗体稀释液(含5％BSA，0.1％NaN3，0.025％Triton X100／PBS) 稀释后抗体的放置时间不宜过久 3 滴加抗体技术: 正常动物血清处理后,倾去多余血清,滴加一抗,其他抗体均在玻片经PBS洗后滴加。 拭去组织周围的液体, 勿使组织干燥; 尽快滴加抗体, 须局限于组织上而成一液滴。 轻轻摇动切片数秒钟, 避免假阴性小区。 4 抗体孵育 (1)时间: 抗体孵育时间越长非特异背景染色越低，特异性抗原染色对比度越佳。 (2)温度: 影响待测抗原染色强度、抗体稀释度的重要因素。 37℃为获得抗原抗体结合最大强度的适宜温度（37℃恒温箱孵育10min）。 孵育温度愈低，则所需孵育时间愈长，抗体稀释度愈高。使用高度稀释的抗体， 可将切片置于4℃冰箱内过夜(约18h)。 4 抗体孵育 一抗孵育：4度过夜（最佳）、室温、37度（1-2h) 4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45分钟 因故必须停止实验的时，将切片置于4℃冰箱内PBS染缸内数小时甚至数日，并不影响染色强度。 二抗孵育：一般室温/37度30min-1h 5 PBS洗涤: （1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。 单独地进行冲洗，冲洗的PBS为一次性，保证切片没有相互交叉污染的机会。 （2）温柔冲洗，防止切片的脱落。 （3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。 （4）PBS的PH和离子强度的使用和要求。 中性及弱硷性条件（PH7-8）利于免疫复合物的形成，酸性条件利于分解； 低离子强度有